一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法

摘要

本发明提供一种从油污土壤中分离并筛选耐盐碱石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集盐碱化石油烃污染土壤，按10％的量添加至原油为唯一碳源的无机盐培养基中，在恒温摇床上进行富集培养。然后取10％富集液接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续驯化培养4～5次，驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高。取驯化完成之后的培养液梯度稀释后涂布于LB-琼脂平板，待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落，并划线纯化，分离单菌。后将分离的单菌涂布于原油无机盐-琼脂平板，检测是否有菌落长出，若有菌落长出，说明该菌株为石油烃降解菌。测定单菌株石油烃降解率，并对其进行16S rDNA分子鉴定，确定菌株的种属关系。

主权项

一种耐盐碱石油烃降解菌的分离筛选方法，其特征在于，其步骤如下：1)取样：采集石油污染盐碱化土壤10g，记录采集位置、土壤含水量、含油量等，进行编号；2)富集培养：将土样按质量体积比10％加入灭过菌的以1％原油为唯一碳源的无机盐培养基(M9MM)中，30℃、160rpm条件下，在恒温振荡器中振荡培养7d；3)驯化培养：然后取富集液10mL接种于新鲜原油无机盐培养基中，相同条件连续培养4～5次，每次驯化为在30℃、160rpm条件下，在恒温振荡器中振荡培养7d。驯化过程中培养基的pH、盐度和原油含量逐渐升高，具体条件如表1所示；4)分离纯化：采用LB固体培养基对第三步中的驯化完成的石油烃降解菌进行涂布分离，待菌落长出后，挑取不同形态的单菌落，划线纯化，取纯化之后的菌落在显微镜下观察菌株是否单一，若为纯菌则在‑80℃甘油保种，若非纯菌，则继续纯化。所述LB固体培养基成分为(1L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15～20g琼脂粉，pH 7.0～7.2；5)石油烃降解检测：将分离纯化完成之后的单菌挑入LB液体培养基中，培养至对数生长期，5000rmp离心5min，用0.85％的氯化钠溶液冲洗两次来除去剩余的碳源，用该氯化钠溶液重悬至原体积，梯度稀释后涂布于M9MM‑琼脂平板，然后取少量灭菌原油涂布于该平板上，恒温培养箱中30℃培养3～5天，观察是否有菌落长出，以及菌落和溶油圈的大小，若有菌落长出，说明该菌能够利用石油烃为碳源生长；6)菌株鉴定：对上述分离出的石油烃降解菌进行分子生物学鉴定，利用OMEGA bio‑tec细菌DNA提取试剂盒D3350‑01对每种菌株的基因组DNA进行提取。提取结果通过1％的琼脂糖凝胶电泳来监测。对提取的DNA进行16S rDNA PCR扩增，将16S rDNA PCR产物送至测序公司测序，然后将测定的序列在GenBank中用Blast软件与已知序列进行同源性分析；7)耐盐碱性检测：以LB液体培养基为基础，将NaCl浓度分别设置为5、10、20、30、50、70、90、110g/L，菌液接种量为1％，pH调至7.0～7.2，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐盐性；以LB液体培养基为基础，将pH值分别设置为5、6、7、8、9、10、11，盐度设置为1％，接种量为1％，30℃、180rpm恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值，测定菌株的耐碱性；8)降解率测定：将适量石油烃加入无机盐培养基(M9MM)中，灭菌之后接种菌液，在150rpm，30℃条件下培养7天。降解完成之后的样品用1∶1H₂SO₄酸化至PH为2，加入1gNaCl(25ml体系)破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯甲烷定容。样品制备完成之后，用配备有HP‑5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪来检测，计算降解率。