主权项 |
一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法,其特征在于包括以下步骤:1)根据葡萄根瘤蚜ITS2序列设计特异性引物:上游引物:5’‑3’AATCCGCAGGTTATACGAACATC SEQ.ID.NO 1下游引物:5’‑3’CGGTCTCGTCAAATTTCGGA SEQ.ID.NO 22)提取基因组DNA提取待检测样品DNA;3)根瘤蚜特异DNA片段扩增:使用步骤2)所述待检测样品DNA进行PCR扩增;PCR扩增体系25μl:10倍的buffer 2.5μl,2.5mM dNTP 2μl,上下游引物(10mM)各0.5μl,模板DNA1μl,taq酶1U,用无菌水补齐;反应程序:95℃预变性5min,95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行32‑35个循环反应;将PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测,凝胶成像系统下观察目的条带,若待检测样品扩增产物中含有114bp片段,则该待检测样品含有根瘤蚜;4)实时荧光定量PCR检测根瘤蚜将上述含有根瘤蚜的待检测样品DNA进行荧光定量PCR扩增;使用SYBR染料法,总反应体系为20μl:2×Ultra SYBR Mixture(With ROX)10μl,所述上、下游引物各0.5μl,模板为2μl,RNase‑Free Water 7μl;反应程序采取两步法PCR:95℃预变性10min;95℃变性10s,60℃退火/延伸1min,进行40个循环反应,建立荧光定量PCR扩增曲线图,根据每个样品孔的荧光强度曲线变化判断根瘤蚜及其含量。 |