一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法

摘要

本发明提供了一种用红豆杉愈伤组织产生紫杉醇的方法，以‘曼地亚’红豆杉叶片为外植体，经消毒、灭菌、接种，培养一段时间后，在叶片伤口处产生愈伤组织，继续对愈伤组织进行增殖培养。取红豆杉叶片愈伤组织研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，收集有机相，过滤后用旋转蒸发器减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、蔗糖等成分；为进行工厂化细胞生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。

主权项

一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，其特征在于：步骤如下：A、外植体的选择和灭菌处理：以红豆杉叶片为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100‑150转摇15‑20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的氯化汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体叶片，接种在培养基中；所述培养基为2，4‑D 3.0‑5.0mg/L、 L‑脯氨酸300‑500 mg/L的SH培养基；C、愈伤组织的诱导：将经过步骤B中得到的外植体叶片，培养于2，4‑D 3.0‑5.0mg/L、 L‑脯氨酸300‑500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.85‑5.95，至出现红豆杉叶片愈伤组织；D、愈伤组织培养：将步骤C中得到的红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2，4‑D1.0‑3.0 mg/L +L ‑脯氨酸300‑500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2℃，光照强度为1000‑1600Lux，光照时间为10‑14小时，培养时间为10‑15天；培养10‑15天后检测愈伤组织中紫杉醇含量；E、紫杉醇提取：将步骤D中的愈伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处理时间为25‑35min，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体溶解于少量甲醇中，0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；F、紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，叶片产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量为3.24mg/L；所述的SH培养基：硝酸钾KNO₃ 2500.00 mg/L，硫酸镁MgSO₄ 195.05 mg/L，磷酸二氢铵(NH₄) H₂PO₄ 300.00 mg/L，氯化钙CaCl₂ 151.00 mg/L，氯化钴CoCl₂·6H₂O 0.10 mg/L，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0. 20mg/L，硼酸H₃BO₃ 5.0 mg/L，碘化钾KI 1.00 mg/L，硫酸锰 MnSO₄H₂O 10.00 mg/L，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.10 mg/L，硫酸锌 ZnSO₄7H₂O 1.00 mg/L，硫酸亚铁FeSO₄7H₂O 27.8 mg/L，Na₂‑EDTA2H₂O 37.3mg/L，甘氨酸2.00 mg/L，盐酸硫胺素，即维生素B1 0.10 mg/L，盐酸吡哆醇，即维生素B6 0.50mg/L，IVB烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L。