一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法

摘要

本发明涉及一种采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR技术)检测不同处理下茶树CBF1(CsCBF1)基因相对表达量的方法，属于生物技术领域。包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤。其特点是以不同处理下茶树叶片cDNA为模板，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因，通过荧光定量PCR技术，在mRNA水平上对CsCBF1进行相对定量分析，为研究CsCBF1基因表达调控奠定基础。与现有技术相比，本发明的检测方法所需时间短，且可以同时分析不同环境处理下CsCBF1基因的表达变化情况，找出能显著诱导CsCBF1基因表达的条件，操作方法简单，所得结果具有重复性好、定量准确等优点。

主权项

一种采用实时定量PCR技术检测茶树CBF1基因表达的方法，其特征在于包括茶苗处理、所取组织RNA提取、cDNA合成、内参基因选择、荧光定量引物设计、荧光定量PCR反应及CsCBF1基因的相对表达量计算七个主要步骤，具体操作方法如下：(1)茶苗处理：将茶苗分别置于低温(4℃、‑5℃)、干旱、激素环境下处理不同时间；(2)所取组织RNA提取：取不同处理下的茶树叶片，利用RNA提取试剂盒，从茶树叶片中提取得到纯化的总RNA；(3)cDNA的合成：以茶树叶片总RNA为模板合成cDNA第一链；(4)内参基因选择：根据实时定量PCR反应内参基因选择要求，选择甘油醛‑3‑磷酸‑脱氢酶(glyceraldehyde‑3‑phos‑phate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参基因；(5)荧光定量引物设计：根据荧光定量PCR引物设计原则，设计CsCBF1基因、GAPDH基因特异性上下游引物yF、yR和GAPDH‑F、GAPDH‑R，引物序列分别为：yF：5’‑TTTGCTGACTCGGTTTGGAG‑3’；yR：5’‑TCGTCTCAGTCGCAGTTTCA‑3’；GAPDH‑F：5’‑TTGGCATCGTTGAGGGTCT‑3’；GAPDH‑R：5’‑CAGTGGGAACACGGAAAGC‑3。(6)实时荧光定量PCR反应：以上述合成的cDNA第一链为模板，yF、yR和GAPDH‑F、GAPDH‑R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应。(7)不同处理下，CsCBF1基因的相对表达量计算：实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算每种处理不同时间下的ΔCt、ΔΔCt、2^‑ΔΔCt值，计算方式如下：ΔCt＝Ct(CsCBF1基因)‑Ct(GAPDH基因)ΔΔCt＝ΔCt(处理N小时)‑ΔCt(处理0小时)以2^‑ΔΔCt数值表示处理时间N小时时，CsCBF1基因相对于GAPDH基因的表达量。