藏药马尿泡自主发根体系的建立方法

摘要

本发明公开了藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，首先对发根农杆菌进行活化，将马尿泡种子无菌苗下胚轴转接至MS固体培养基中，放置于22℃生化培养箱中暗培养48h，完成下胚轴的预培养阶段；使用发根农杆菌浸染及共培养；转接至含有500mg/L羧苄青霉素的MS培养基中于22℃条件下进行暗培养，下胚轴伤口愈伤组织处产生白色不定根。本发明的有益效果是研发了高产东莨菪碱的马尿泡转基因发根生物反应器。

主权项

藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：发根农杆菌的活化；将低温保存的发根农杆菌取出，在发根农杆菌培养基平板上划线，然后放置在25℃的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌落再次在发根农杆菌培养基平板上划线，放置在25℃的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌落接种在含有30mL发根农杆菌液体培养基的三角瓶中，28℃，180rpm震荡培养12‑15h，培养至菌液吸光值浓度为OD₆₀₀＝0.6‑0.8，然后将菌液转入50mL离心管中，6000r/min，离心10min，用MS液体培养基重悬至OD＝0.6，菌悬液备用；步骤2：外植体的预培养；将生长15‑20d左右的马尿泡种子无菌苗取出，切去种子无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至MS固体培养基中，放置于22℃生化培养箱中暗培养48h，完成下胚轴的预培养阶段；步骤3：发根农杆菌浸染及共培养；取出与预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染9‑10min，然后将浸染后的下胚轴取出，除去表面多余菌液，然后接种在MS固体培养基中，放置于28℃生化培养箱培养48h；步骤4：除菌培养；在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至含有500mg/L羧苄青霉素的MS培养基中于22℃条件下进行暗培养，下胚轴伤口愈伤组织处产生白色不定根。