一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法

摘要

本发明涉及外周血有核细胞胞内蛋白质的检测方法，该方法先利用固定液将有核细胞固定，再利用破膜剂对有核细胞破膜的同时裂解红细胞，简化实验步骤，提高红细胞裂解效果。

主权项

一种检测外周血有核细胞胞内γ‑H2AX蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤：1)在外周血样品中加入5倍体积固定液，室温作用30分钟；2)室温离心500g 5分钟，去上清；3)加入洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心500g 5分钟，去除上清，保留沉淀；4)加入5倍外周血样品体积的破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min；5)室温离心500g 5分钟，去上清；6)加入洗液洗涤细胞，室温离心500g 5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；7)重复步骤6)；8)在细胞沉淀中加入γ‑H2AX蛋白质特异性抗体，混匀后37℃条件下作用30min；9)加入洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的特异性抗体；10)重复步骤9)；11)加入荧光标记第二抗体，混匀后37℃避光作用30分钟；12)加入洗液洗涤细胞，去除上清；13)重复步骤12)；14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4℃保存直至利用流式细胞仪或荧光显微镜检测分析；15)对于检测的样品，均需设定未加入γ‑H2AX蛋白质特异性抗体的对照样品；16)数据分析，与对照样品相比，荧光细胞数目和/或荧光强度增加为阳性结果，荧光细胞数目和/或荧光强度没有改变为阴性结果；所述步骤1)中固定液为溶解于PH＝7.2磷酸盐缓冲液中的2％(w/v)多聚甲醛溶液，加入固定液体积为起始外周血样品体积的5倍；所述步骤4)中破膜剂为溶解于PH＝7.2磷酸盐缓冲液中的0.04％(v/v)Triton‑100溶液，加入破膜剂的体积为起始外周血样品体积的5倍；所述步骤3)、6)、7)、9)、10)、12)、13)中洗液为PH＝7.2的磷酸盐缓冲液，加入洗液体积为起始外周血样品体积3‑5倍；所述的检测方法用于非诊断目的。