基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-489检测试剂盒及其检测方法

摘要

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-489检测试剂盒及其检测方法，涉及MicroRNA。试剂盒设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入试剂盒提供的浓度为5nmol的外源性参照cel-miR-395μL，漩涡震荡15s；若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39；采用试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA；采用试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。

主权项

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa‑miR‑489检测试剂盒，其特征在于所述hsa‑miR‑489为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1 5＇‑UGGGUUUACGUUGGGAGAACU‑3＇；所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa‑miR‑489检测试剂盒，设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂；所述外源性参照采用cel‑miR‑39，所述cel‑miR‑39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为：SEQ ID NO.2 5＇‑UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG‑3＇；其工作浓度为5nmol；所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl₂、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为100n mol；所述5×RT缓冲液由250m mol Tris‑HCl、375m mol KCl、15m mol MgCl₂、50m mol DTT组成；所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol的MgCl₂、5单位/μL的Taq聚合酶、10m mol dNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针；所述10×Taq缓冲液包括100m mol Tris‑HCl，500m mol KCl；所述AllGlo探针由hsa‑miR‑489的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel‑miR‑39的特异探针组成；所述hsa‑miR‑489的特异探针的核苷酸序列为：SEQ ID NO.10MAR‑TTGCACTGGATACGACAGTTCTCC‑MAR；所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为：SEQ ID NO.11JUP‑CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC‑JUP；所述外源性参照cel‑miR‑39的特异探针的核苷酸序列为：SEQ ID NO.12JUP‑TGCACTGGATACGACCAAGCT‑JUP。