一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法

摘要

本发明公开了一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，涉及植物内源细胞分裂素的测定领域。本发明包括以下步骤：①内源细胞分裂素的提取：通过加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成內源细胞分裂素的提取；②固相萃取洗脱：溶解内源细胞分裂素并获得溶解液，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③高效液相色谱-质谱分析。本发明前处理简单，化学试剂用量少，有效节约成本，杂质干扰小；检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生；实现了在植物样品的粗提取液中直接进行多种內源细胞分裂素的检测；其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法适用于草坪草内源细胞分裂素，回收率高，达93～96%。

主权项

一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，其特征包括以下步骤：①内源细胞分裂素的提取：通过加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成內源细胞分裂素的提取；②固相萃取洗脱：溶解内源细胞分裂素并获得溶解液，过96孔的固相萃取小柱逐步洗脱，获得內源细胞分裂素洗脱液，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③高效液相色谱‑质谱分析：将固相萃取洗脱物用流动相溶解，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱‑质谱进样分析；所述的步骤①内源细胞分裂素的提取：A、浸提：取0.5g鲜样，用液氮研磨，然后加提取液5ml，‑20℃提取过夜，得浸提液；所述的提取液即甲醇：甲酸：水＝15：1：4，按v/v，再加40mg/ml 2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚作为抗氧化剂；B、离心：将浸提液在15000转/min，4℃下离心10min，收集上清液置于新管并保存于‑20℃，残渣再用5ml提取液于‑20℃提取1h，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；C、过滤：将收集的离心液过20μm滤膜以去除残渣和较小的颗粒物，收集滤液，得过滤液；D、脱色：先用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将过滤液过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取小柱，并连接上真空泵，以1ml/min的速度抽滤，以去除色素和脂类物质；过小柱后，收集滤液，再用1ml的样品提取液洗脱小柱中的样品并收集滤液，得脱色滤液；E、真空浓缩：将收集的脱色滤液置于真空浓缩仪中，于40℃浓缩至完全干燥，即完成内源细胞分裂素的提取；所述的步骤②固相萃取洗脱：A、用2ml 1mol/L甲酸溶解步骤①真空浓缩得到的沉淀，以获得甲酸溶解液；B、用1ml 100％甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取小柱，然后将甲酸溶解液过小柱以吸附激素，弃滤液；C、用1ml的1mol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，弃滤液；D、用2ml 0.35mol/L的氨水冲洗小柱，弃滤液；E、用2ml 60％甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集滤液，该收集液中含有细胞分裂素(Z，ZR，DHZ，DHZR，iP，iPA)；F、将洗脱液置于真空浓缩仪中40℃浓缩至完全干燥；G、过程B至E需将96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取柱置于真空抽滤装置上并连接真空泵，以1ml/min的速率进行抽滤，以提高洗脱效率；所述的步骤③高效液相色谱‑质谱连用分析：A、将步骤②的固相萃取洗脱真空浓缩获得的沉淀用200～500μl流动相溶解，得流动相溶解液；B、用一次性医用注射器吸取流动相溶解液过0.22μm滤膜后装至进样瓶中，上效液相色谱‑质谱进样分析；C、如样品量过少，样品装入带内撑管的进样瓶中进行上机分析；D、色谱柱为安捷伦Zorbax SB‑C18液相色谱柱，柱温为30℃，流速为200μl/min，紫外检测波长为265nm，进样量为10μl；细胞分裂素Z，ZR，DHZ，DHZR，iP，iPA的流动相：时间min流动A 0.1％甲酸水流动相B 100％甲醇080％20％580％20％1055％45％2055％45％355％95％505％95％50.180％20％5580％20％E、质谱条件为：离子源选择ESI源，离子检测模式选择MRM，电喷雾电压为3500V，质谱扫描范围50～600m/z，扫描速度22000m/z/s；內源细胞分裂素离子及碰撞能量：激素母离子子离子碰撞能量离子模式Z220.13119.22141V正离子ZR352.245136.00429V正离子DHZ222.148136.16720V正离子DHZR354.2495.15380V正离子iP204.15136.18722V正离子iPA336.203204.32917V正离子。