一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法

摘要

本发明公开了一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法。利用受体-配体亲和反应原理，将中草药样品与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子混合孵育，使中草药样品中活性成分的混合物与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子混合，得到活性成分与酶负载的磁性纳米粒子复合物。通过外界磁场作用进行磁分离，将复合物采用甲醇-水的混合溶液脱附，收集脱附液，运用液相色谱-质谱联用技术对得到的活性成分进行分离和鉴定。该方法避免了传统筛选方法筛选时间较长且有机溶剂消耗大的问题，其操作简便、迅速、酶负载的磁性纳米粒子复合物可重复使用，适于快速筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂，为寻找高活性的新型抗痛风药物奠定基础。

主权项

一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物的应用方法，其特征在于，100mg粒径在30～220nm的四氧化三铁纳米粒子分散在200mL乙醇溶液中，向溶液中逐滴滴加2mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷；室温下搅拌6小时后用乙醇溶液洗涤三次，置于50℃真空干燥箱中干燥；2mg氨基化的四氧化三铁纳米粒子分散在2mL 5％w/v的戊二醛溶液中，并搅拌1小时，反应后将磁分离得到的磁性纳米粒子加入到4mL的黄嘌呤氧化酶溶液中，该溶液浓度为180μg/mL，并采用pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液配制，振荡反应2小时；得到黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子用磷酸盐缓冲液洗涤后待用；将20mg黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子加入到2mL葛花提取液中，在25℃下振荡1小时；磁分离收集磁性纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液洗涤三遍后，加入2mL 80％的甲醇溶液并振荡5min脱附已结合的活性成分，将脱附液收集并进行高效液相色谱‑质谱分析；葛花中药提取液的制备：将原料按照固液质量比为1：10的比例，用95％的乙醇溶液在85℃回流提取3小时，减压蒸馏至95％的乙醇溶剂全部蒸除得到浸膏；将上述浸膏按照固液质量比为1：100的比例用二次蒸馏水溶解，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分别通过减压蒸馏蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位样品；将乙酸乙酯部位样品按照固液质量比为1：100用100％甲醇溶液溶解，过0.45μm滤膜备用；用Dionex UltiMate 3000型高效液相色谱仪进行高效液相色谱检测，条件如下：色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm；流动相：A相：含0.4％醋酸的水，B相：含0.4％醋酸的乙腈；梯度洗脱程序：t＝0～12min，25％B相+75％A相；t＝12～15min，25～30％B相+75～70％A相；t＝15～30min，30～38％B相+70～62％A相；t＝30～33min，38～75％B相+62～25％A相；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；质谱条件如下：A Finnigan LCQ^deca plus离子肼质谱仪，采用负离子电离模式，流速为0.2mL/min，扫描范围：m/z 100‑1200，实验前质量数均经过校正；喷雾电压为3.5kV，金属加热毛细管温度350℃，金属毛细管电压5V，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min。