利用人工合成MV4序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法

摘要

一种利用人工合成MV4序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV4序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。

主权项

一种利用人工合成MV4序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV4序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：(1)MV4序列的人工合成：从ScMV和SrMV核酸序列中各选取一段串联在一起，获得MV4序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：(2)RNAi载体构建：(a)目的片段Ⅰ的获得：利用限制性内切酶Xho I和Kpn I将目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；目的片段Ⅰ的序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(b)目的片段Ⅱ的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Xho I和Kpn I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，目的片段Ⅱ的序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(c)中间载体B的获得：将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；所述中间载体B是指将目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；(d)目的片段Ⅲ的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；目的片段Ⅲ的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；(e)目的片段Ⅳ的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ；目的片段Ⅳ的序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；(f)中间载体C的获得：将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；所述中间载体C是指将目的片段Ⅳ插入到中间载体B后获得的载体；(g)目的片段Ⅴ的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ；目的片段Ⅴ的序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；(h)目的片段Ⅵ的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ；目的片段Ⅵ的序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；(i)抗甘蔗花叶RNAi载体pG0229i‑MV4的获得：将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi载体pG0229i‑MV4；(3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi载体pG0229i‑MV4质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μl，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。