转植酸酶基因玉米或饲料中植酸酶基因的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种转植酸酶基因玉米种子或含有该玉米种子的饲料中植酸酶基因的定量检测方法，包括以下步骤：(1)建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；(2)以待检测样品的DNA为模板，分别以扩增玉米内参基因的一对特异引物、扩增植酸酶基因的一对特异引物或者扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，计算出Ct值差值，将Ct值差值代入所构建的标准曲线和线性方程，得到待检测样品中植酸酶基因的含量。本发明方法能够快速、准确、高通量的测定转基因玉米或添加了转植酸酶基因玉米饲料中的转植酸酶基因的含量，具有操作简便、准确、灵敏度高、避免交叉污染等优点。

主权项

一种转植酸酶基因玉米种子或含有转植酸酶基因玉米种子的饲料中植酸酶基因的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照以下方法建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程：(a)制备转植酸酶基因玉米的标准品DNA或含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA；所述转植酸酶基因玉米的标准品DNA按照以下方法制备得到：将转植酸酶基因玉米基因组DNA与非转基因玉米基因组DNA按梯度比例混合，控制转植酸酶基因玉米的标准品DNA中转植酸酶基因玉米基因组DNA含量分别为0.5％，1％，2％，5％，10％；所述含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA按照以下方法制备得到：将添加有转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA与未添加转基因玉米的饲料基因组DNA按照梯度比例混合，控制转植酸酶基因玉米饲料基因组DNA含量分别为2％，5％，10％，20％，50％；(b)以所制备的标准品DNA为模板，以扩增玉米内参基因的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准品DNA中内参基因Ct值；以所制备的标准品DNA为模板，以扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准品DNA中植酸酶基因的Ct值；(c)按照以下方法建立转植酸酶基因玉米的定量检测标准曲线和线性方程：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以转植酸酶基因玉米标准品DNA中转植酸酶基因玉米基因组DNA含量的0.5％，1％，2％，5％，10％为横坐标，建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；按照以下方法建立转植酸酶基因玉米饲料的定量检测标准曲线和线性方程：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以标准DNA中转植酸酶基因玉米饲料的基因组DNA含量的2％，5％，10％，20％，50％为横坐标，建立定量检测标准曲线和线性方程；(2)以待检测样品的DNA为模板，分别以扩增玉米内参基因的一对特异引物、扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，计算出二次实时荧光定量PCR扩增的Ct值差值，将Ct值差值代入步骤(1)所构建的标准曲线和线性方程，得到待检测样品中植酸酶基因的含量；所述的玉米内参基因是Maize actin 1；所述植酸酶基因是PhyAO基因；用于扩增玉米内参基因的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述的扩增植酸酶基因的一对特异引物选自由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成的引物对或由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示核苷酸序列组成的引物对；所述扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。