一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法

摘要

本发明公开了一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，属于植物病原菌分离技术领域。其包括如下步骤：(1)病原菌的分离；(2)病原菌的培养；(3)病原菌的电子显微镜检测；(4)病原菌的等温PCR鉴定。本发明既实现了甘蔗梢腐病的病原菌的体外分离、培养，又实现了甘蔗梢腐病的病原菌的快速鉴定，且可以准确检测甘蔗种子、亲本资源和育种中间材料在生长早期是否含有甘蔗梢腐病原复合物，将有效推动甘蔗的科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。

主权项

一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)病原菌的分离：①将患有梢腐病的甘蔗植株A的发病叶片的表面用水清洗干净，然后从染病部位、健康部位、病健交界处分别切取叶片组织，再分别用酒精、升汞消毒，然后用无菌水冲洗，吸干表面水分，得到组织切片；②将步骤①所得组织切片接种于PDA培养基上，于28℃培养3～4d，当培养出的菌落直径≥1cm时，挑取菌落边缘菌丝接种于新的PDA培养上，于28℃培养3～4d，重复上述操作≥3次，得到纯化菌种；③将步骤②所得纯化菌种回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的发病症状与甘蔗植株A的相同，前述纯化菌种即可作为分离后的病原菌，于4℃保存，待用；(2)病原菌的培养：将步骤(1)所得分离后的病原菌，接种于PDA培养基上，于28℃培养3～4d，即得培养后的病原菌；(3)病原菌的电子显微镜检测：取步骤(2)所得培养后的病原菌，置于电视相差显微镜检测，若呈下述症状，则可初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌：呈串珠状，淡黄色，有时菌丝组合成孢梗束，小型分生孢子单细胞，长卵形，大小为6.5～11μm×2.8～3.5μm，串生在分生孢子梗顶部；大型分生孢子镰刀形，具隔膜3～7个，大小为30～65μm×3.5～4.2μm，生在气生菌丝上或分生孢子座中；(4)病原菌的等温PCR鉴定:将步骤(3)所得初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌，进行PCR鉴定：①引物序列为：正向引物为PBD1:5'‑CTCTTGGTTCTGGCATCG‑3'，反向引物为PBD2:5'‑GTTCAGCGGGTATTCCTA‑3'，预期扩增产物长度为545‑546bp；②模板DNA的制备：a、挑取菌丝至2.0mL离心管中；b、加入现配的50μL Buffer A，混匀后，离心，得到上清液A；c、将上清液A于95℃放置10min后，立即置于冰块上放置3min；d、加入现配的50μL Buffer B，混匀后，离心，得到上清液B；e、在上清液B中，加入等体积的氯仿‑异戊醇溶液，剧烈摇匀后，离心，得到上清液C，轻轻吸取上清液C至另一新的离心管，制成模板，待用；③等温PCR扩增体系：含20mmol/L Tris‑HCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、2mmol/L MgSO₄、0.1％Tween20、25℃的pH为8.8的1×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、ddH₂O 18.8μL、10mmol/L的dNTPs Mixture 0.5μL、10μmol/L的PBD1 1μL、10μmol/L的PBD21μL、5U/μL的Bst 2.0DNA Polymerase 0.2μL、模板DNA 1μL；④等温PCR扩增程序:65℃等温45min，80℃失活20min，‑20℃保持；⑤取PCR扩增后的反应液5μL，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在550bp处出现单一扩增条带的为甘蔗梢腐病原菌，不出现单一扩增条带的不是甘蔗梢腐病原菌。