一种发光检测试剂盒及其制备方法

摘要

一种检测人血管内皮生长因子（VEGF）的化学发光检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF受体及单克隆抗体联合包被的发光反应板、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、VEGF标准品、样品稀释液、PBST浓缩洗液、鲁米诺配置的发光底物、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。

主权项

一种发光检测试剂盒的制备方法，发光检测试剂盒组成为：反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A、B和封板胶纸；所述反应板为VEGF受体和VEGF单克隆抗体联合包被的反应板；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体，1瓶；所述标准品为VEGF标准品，2支；所述样品稀释液：0.05％吐温‑20,1％牛血清白蛋白，10mM乙二胺四乙酸二钠，0.05％硫柳汞，0.4M NaCl，pH 6.5，1瓶；所述浓缩洗涤液为：137mM NaCl，2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄,0.05％吐温‑20，pH 7.4，1瓶；所述发光底物A、B，其中发光底物A为H₂O₂溶液，发光底物B为鲁米诺溶液，各1瓶；所述封板胶纸2张；所述的各种物质量均以反应板为96孔计算的；所述试剂盒的制备方法：VEGF基因和VEGF受体基因的克隆，以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应即PCR，依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件：94℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃保温10分钟，依据VEGF受体基因的报道序列设计引物，PCR反应条件：94℃变性40秒，52℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环后72℃保温10分钟；反应体系：凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体pMT18‑T中，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒进行酶切鉴定，VEGF基因的重组质粒命名为pMT18‑1，VEGF受体基因的重组质粒命名为pMT18‑2；昆虫表达载体的构建，用SalⅠ、BamHⅠ分别酶切质粒pMT18‑1和pMT18‑2，分别回收VEGF基因片段和VEGF受体基因片段，同时用SalⅠ、BamHⅠ酶切质粒pFastBac‑HT,回收4.7kb片段，将VEGF基因片段和VEGF受体基因片段分别与4.7kb片段进行连接，构建载体pFastBac‑1和pFastBac‑2，用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确；分别将载体pFastBac‑1和pFastBac‑2转化DH10Bac感受态细胞，采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑，将菌落挑到2ml LB培养基中，37℃,250rpm振荡培养12小时；提取培养的菌液中的质粒方法如下：将1.5ml菌液转入离心管中，10,000rpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；加300μl溶液Ⅰ在震荡器上振荡混匀，所述溶液Ⅰ为50mM葡萄糖，25mM Tris‑HCl,10mM EDTA,pH 8.0；加300μl现配的溶液Ⅱ，混匀，室温放置5分钟，所述溶液Ⅱ为0.2N NaOH，1％SDS；加300μl预冷的溶液Ⅲ，冰浴5分钟，所述溶液Ⅲ为5M KAc，pH 5.5；12,000rpm离心15分钟；转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；10,000‑12,000rpm离心10分钟；用70％和无水乙醇洗涤沉淀；吹干，溶于50μl加RNase的T E中，所述TE为10mM Tris‑HCl；1mM EDTA，pH 8.0，于37℃放置一小时，置于‑20℃备用；对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法；转染昆虫细胞，以sf9细胞为例；sf9细胞培养于Grace培养液中，添加15％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50ug/ml，转染方法如下：转染前一天将细胞分到24孔板；转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500μl培养液；在50μl无血清、无双抗培养液中分别加入2μl脂质体、5μl前述的重组质粒，室温放置5分钟，将质粒加入到脂质体中，室温放置20分钟；将上一步骤的混合物加到细胞中，27℃培养；转染4小时后，吸掉培养液，加入1ml新鲜有血清、有双抗Grace培养液，27℃培养72小时；转染72小时后，观察是否有出毒迹象；将有杆状病毒上清感染新sf9细胞；昆虫表达蛋白的纯化即Ni柱吸附法，Ni柱的制备，取1ml Ni‑NTA到一离心管中，1500g离心5分钟；去掉上清，将Ni‑NTA用1倍体积的洗涤缓冲液重悬，所述洗涤缓冲液为20mM Tris‑HCl,500mM KCl,20mM咪唑，2mM巯基乙醇，10％甘油，pH 8.5；将重悬液倒入柱中，用5‑10倍体积的wash buffer平衡；细胞抽提物的准备，500g离心5分钟收集50ml细胞；用裂解缓冲液重悬细胞，所述裂解缓冲液为50mM Tris‑HCl,100mM KCl,20mM咪唑，5mM巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，pH 8.5；10,000g离心10分钟，将上清液转移到一新管中；蛋白纯化，将上一步骤的上清液加到平衡好的Ni柱中；用10倍体积的buffer A洗柱，所述buffer A为20mM Tris‑HCl,500mM KCl,20mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH 8.5；用2倍体积的buffer B洗柱，buffer B为20mM Tris‑HCl,1M KCl,20mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH 8.5；用2倍体积的buffer A洗柱；用5‑10倍buffer C洗脱，收集洗脱液，所述buffer C为20mM Tris‑HCl,100mM KCl,100mM咪唑，5mM巯基乙醇，10％甘油，pH 8.5；用SDS‑PAGE胶检测所纯化蛋白的浓度与纯度；VEGF单克隆抗体的制备及纯化，以小鼠为免疫动物，重组VEGF165为抗原进行免疫，根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此一个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开，待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，可认为克隆完成，由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体，正辛酸—硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95％以上；VEGF多克隆抗体的制备、纯化及标记，用家兔作为免疫动物，先用5‑10mg卡介苗注射刺激动物，一周后，将VEGF蛋白制成弗氏完全佐剂，采用皮下多点注射进行第一次免疫，2周后，进行第二次免疫，2周后，试血并测效价，如效价偏低，则进行加强免疫；采集家兔全血，离心取血清，向血清中加入饱和硫酸铵，血清与硫酸铵的体积比为2:1，使抗体沉淀，离心分离，抗体纯度达98％以上；采用戊二醛法将辣根过氧化物酶即HRP标记到VEGF多克隆抗体上；试剂盒的制备：反应板的包被采用以下步骤：受体及单克隆抗体用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加100μl，37℃水浴或温箱中包被2小时，然后放在室温过夜，每孔加满PBST洗涤液，放置30秒左右，甩干，每孔加120μl封闭液，室温放置2小时，封闭液配方主要含有BSA、一些盐类，甩掉封闭液，拍打除去残余封闭液，超净台上吹干，或超净台上吹数小时，然后室温放置过夜，用真空包装机进行包装；试剂盒使用方法，从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4℃；留一孔为空白孔，其他各孔加入样品稀释液100μl；除空白孔外，加入标准品稀释液，用标准品稀释8个梯度、血清标本各100μl至相应孔中，轻弹混匀，用封板胶纸封住反应孔，37℃60分钟；洗板步骤：(1)自动洗板机，甩尽孔内液体，要求注入的洗涤液为350μl，注入与吸出间隔15‑30秒，洗板3次；或者(2)手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗3次；除空白孔外，每孔加酶联物200μl，封住板孔，37℃60分钟；洗板3次；发光反应：将发光底物A、B液各100μl加到反应孔，包括空白孔内；轻微振荡30秒，室温，避光反应5分钟后，用化学发光仪测定各孔发光值；以标准品浓度值为横坐标，以标准品发光强度值为纵坐标，建立标准曲线，计算测定结果。