一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种用于功能研究的miR-505高表达载体的构建方法，包括：（1）采用PCR方法得到shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR-505片段；（2）将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与经EcoRI酶切后的miR-505片段进行连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR和BamHI酶切检测目的基因插入的方向和拷贝数，测序确认后，得到表达载体。本发明的构建方法操作简单，得到的载体可实现miR-505成熟体在哺乳动物细胞中的高表达。

主权项

一种用于功能研究的miR‑505高表达载体的构建方法，包括：(1)采用PCR方法将microRNA‑505的shRNA基因从pcDNA^TM6.2‑GW/EmGFP‑miR‑505扩增得到包含miR‑505‑3p、miR‑505‑5p及miR‑505‑nc的shRNA基因，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到经EcoRI酶切后的miR‑505片段；其中PCR方法中所用的一对引物如下：PcDNA‑left：5’CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG；PcDNA‑right：5’CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC；其中miR‑505‑3p、miR‑505‑5p及miR‑505‑nc的序列如下：(2)将FUGW载体或Fsy载体用EcoRI进行酶切，并CIAP处理使其5’端去磷酸化，然后将处理后的线性化FUGW载体或Fsy载体与步骤(1)得到的经EcoRI酶切后的miR‑505片段进行连接，再转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，并涂布到1％氨苄抗性的琼脂糖平板至长出菌落，对单菌落进行PCR鉴定，初步确定阳性克隆并根据PCR产物大小推测插入片段的拷贝数；将阳性克隆提取质粒后，进行BamHI的酶切，根据产物大小确认外源片段插入的方向，将正确插入的片段进行测序确认，得到表达载体。