基于共有表位甲型流感病毒抗体通用型竞争性ELISA检测方法

摘要

本发明公开了一种基于共有表位甲型流感病毒抗体通用型竞争性ELISA检测方法，采用包含甲型流感病毒特异性表位序列的多肽作为包被抗原，采用特异性型单克隆抗体作为检测抗体，以提高检测特异性；应用竞争性ELISA方法，酶标二抗统一采用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgGFc片段的多克隆抗体，能检测除鼠以外的所有动物，包括野生哺乳动物和野生鸟类等及人血清样品中的甲型流感病毒抗体，排除宿主动物种类的限制；包被抗原和单克隆抗体均基于甲型流感病毒共有表位，检测甲型流感病毒共有的型特异性抗体，不受感染病毒亚型限制。本发明适用于检测动物及人血清、血浆及相关液体样本中甲型流感病毒抗体。

主权项

一种基于共有表位甲型流感病毒抗体通用型竞争性ELISA检测方法，其特征在于，该基于共有表位甲型流感病毒抗体通用型竞争性ELISA检测方法包括以下步骤：步骤一，采用分别含有甲型流感病毒核蛋白上的2个型特异性表位和甲型流感病毒基质蛋白上的1个型特异性表位序列的多肽，使用前预混合，作为包被抗原；步骤二，将包被抗原用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释到工作浓度，加至96孔ELISA板，每孔加50μL，振荡混匀，4℃保湿过夜，用PBST洗板5次，铝箔纸密封4℃保存；步骤三，采用2株针对甲型流感病毒核蛋白的型特异性单克隆抗体和1株针对甲型流感病毒基质蛋白的型特异性单克隆抗体，使用前预混合，作为检测抗体；步骤四，加样，将待检血清用PBST‑SM作1：5稀释，每孔加50μL，每份样品使用两孔，空白对照两孔，各加PBST‑SM 50μL；强阳性血清对照两孔，各孔加50μL；弱阳性血清对照两孔，各加入50μL；阴性血清对照两孔，各加入50μL；置37℃温箱振荡温育反应30min；步骤五，将检测抗体用PBST‑SM稀释到工作浓度，每孔加50μL；置37℃温箱振荡温育反应30min；用PBST洗板5次，甩干；加酶标二抗，将HRP标记的兔抗鼠IgG FC片段的多克隆抗体用PBST‑SM稀释到工作浓度，每孔加50μL；置37℃温箱振荡温育反应30min；洗板，用PBST洗板5次，甩干；步骤六，加底物和终止，按以下比例配置底物工作液：9.7mL乙酸‑‑柠檬酸缓冲液+50μL30％过氧化氢+300μL四甲基联苯胺储存液，每孔100μL加至ELISA板，室温避光反应10min～20min，用2mol/L的硫酸每孔50μL，终止反应；步骤七，读数和判定，读数：在终止反应15min内，用酶标读板仪读取450nm波长的每孔吸光度值，计算抑制率；判定条件：阴性对照OD值应在0.8～1.4范围内，强阳性对照抑制率应大于85％，弱阳性抑制率应在35％～50％之间，如果实际值与此值偏离较大，则不具备判定条件，需重复或重新滴定各组份工作浓度；在步骤七中，抑制率的计算公式为(1–待检样品OD值/阴性样品OD值)X 100；样品的抑制率大于60％判定为甲型流感病毒抗体阳性，小于40％判定为阴性；40％～60％之间应重复，若仍为此值可判定为弱阳性。