一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法

摘要

一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液染毒，4）LDH测定，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。本发明的评价方法通过细胞接种密度的优化、细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度，并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映电子烟烟液对细胞膜的损伤程度，揭示电子烟的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

主权项

一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1） 配制实验试剂：（1）LDH基质液的配制：用0.2 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐‑盐酸（Tris‑HCl）缓冲液（pH8.2）配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为：乳酸锂5×10‑² mol/L、硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10^‑4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10^‑4 mol/L、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）1.3×10^‑3 mol/L，LDH基质液应在临用前配制；（2） 细胞裂解液： 20%的曲拉通100（Triton‑100）；（3）终止液：4M的盐酸（HCl）溶液；（4）细胞培养基：溶剂为RPMI‑1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L‑谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；（5）电子烟烟液染毒溶液：用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制，电子烟烟液染毒浓度范围10mg/ml~120 mg/ml，设置不少于7个非零染毒浓度；2）细胞接种：所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，向96孔板的每孔中加入100 μL细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，选择LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期的细胞个数作为最优细胞接种密度，本发明中CHO细胞的最佳接种密度为10000个/孔；3）电子烟烟液染毒：细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每6 孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μl的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μl不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入7个剂量中的最高剂量电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；4）LDH测定：染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5μl裂解液，染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基质液，反应一段时间后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光值；5）结果与分析原始吸光值A ：A = A490 nmA(染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值A(最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值。