一种家蚕成品卵中微孢子虫数量水平的检测方法

摘要

本发明提供了一种家蚕成品卵中微孢子数量水平的检测方法。根据家蚕微孢子虫DNA序列设计特异性引物，以待检蚕卵内的总DNA为模板，进行荧光定量PCR（Q-PCR）扩增，获取检测样品的Ct值；同时，以不同拷贝数重组家蚕微孢子虫DNA为模板，进行Q-PCR扩增，以Ct值为纵坐标，起始质粒DNA的拷贝数的对数值为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程；根据回归方程和检测样品的Ct值计算检测样品中家蚕微孢子虫DNA起始拷贝数，从而推测样品中家蚕微孢子虫的数量水平。本发明可以根据检测样品中家蚕微孢子虫DNA的拷贝数直接判别微孢子虫的数量水平。根据成品卵中微孢子虫的数量水平评估后续饲养中发生微粒病的风险比根据成品蚕卵微粒子病病卵率评估更科学。

主权项

一种用于非诊断的家蚕卵中微孢子虫（Nosema bombycis）数量水平的检测方法，其特征在于它包括以下步骤：1）提取100粒家蚕卵中微孢子虫DNA；2）根据家蚕微孢子虫16S rRNA基因序列设计一对引物5’gtacacaccgcccgtcgctatc3’和5’cctgctaatggttctccaacagc3’，或根据5S rRNA基因序列设计一对引物5’ctcttatccagatacggccata3’和5’cccttcttagactaattaagctc3’；3）以步骤1获得的DNA为模板，使用步骤2）合成的引物，进行荧光定量PCR，将获得的Ct值记为S；4）使用步骤2）合成的引物，以家蚕微孢子虫的DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物克隆到常规载体，获得克隆载体；5）将步骤4）获得的克隆载体稀释成一个浓度梯度，以不同浓度梯度克隆载体为模板，使用步骤2）合成的引物，进行荧光定量PCR，使用记录的Ct值对质粒浓度做标准曲线；6）根据标准曲线计算出当Ct值为S时的DNA模板拷贝数，进一步获得微孢子虫数量水平。