肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法

摘要

本发明公开了富集分离肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）的方法，为目的菌更好地进行后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括树枝状聚合物与抗体共价偶联、长链生物素封闭抗体-树枝状聚合物的裸露氨基、树枝状聚合物偶联的抗体捕获样品液中的目的菌、纳米磁珠偶联的链霉亲和素识别并偶联样品液中的长链生物素化的树枝状聚合物、细菌的磁分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法更适用于在复杂基质中对细菌进行磁分离，提高了样品中目的菌分离效率。

主权项

肺炎链球菌在复杂基质中的分离方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取3.6 mg树枝状聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N‑羟基丁二酰亚胺，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；加入10.5 mg 肺炎链球菌特异性抗体，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树枝状聚合物‑抗体复合物；（2）取15 mg 长链生物素，3.6 mg N‑羟基丁二酰亚胺，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；加入0.55 mg树枝状聚合物‑抗体复合物，室温置于混匀仪上搅拌30 min；真空干燥后，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素‑树枝状聚合物‑抗体复合物；（3）取1 mL待测样品溶液，加入0.1 mg 的长链生物素‑树枝状聚合物‑抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；常规磁力架分离3 min；所述修饰有链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20‑50 nm；（4）磁分离后，用0.1% PBST洗涤后，用PBS缓冲液重悬即得到富集有肺炎链球菌的纳米磁珠‑链霉亲和素‑长链生物素‑树枝状聚合物‑抗体‑肺炎链球菌抗原复合物；所述树枝状聚合物为氨基化的聚酰胺‑胺型树枝状聚合物，其分子量为42000 Da。