一种在植物中快速表达外源蛋白的方法

摘要

本发明属于一种在植物中快速表达外源蛋白的方法。该方法包括以下步骤：①植物材料的准备；②病毒载体的构建；③农杆菌重悬液的制备；④利用高压喷枪系统侵染植物；⑤侵染后植物材料的培养与观测；⑥GFP的快速表达及检测。本发明为植物中简便、快速表达外源蛋白的一种新方法，利用该方法成功表达了绿色荧光蛋白GFP。在大量优化实验中，申请人对影响基因表达的各种因素进行了较为全面具体的研究，确定该方法最适侵染条件，包括菌液重悬液（MMA OD600）浓度，适合该方法的植物材料及侵染时期，植物材料培养的温度条件等。

主权项

一种在植物中快速表达外源蛋白的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：①、植物材料的准备：植物材料为烟草，将烟草Nb的种子播种于1/2MS培养基中，放于光照培养箱，培养7‑8天长出烟草小苗，将烟草小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下培养18‑20天，烟草小苗的苗龄在四叶期—六叶期，作为植物材料备用；上述步骤中对植物材料侵染时期进行了优化，即分别选择苗龄为四叶期，五叶期和六叶期的烟草小苗，每个时期选择20株烟草小苗作为植物材料；②、病毒载体的构建：先将要表达的外源基因GFP连接在病毒载体p35S‑30B上，再将质粒p35S‑30B‑GFP转化农杆菌EHA105，28℃条件下过夜培养，获得携带病毒载体和外源基因GFP的农杆菌EHA105‑p35S‑30B‑GFP的单菌落；③、农杆菌重悬液的制备：挑取上述步骤②中培养的单菌落EHA105‑p35S‑30B‑GFP放入5ml LB培养基中，5ml LB培养基中添加浓度为50mg/ml的卡那霉素5ul、50mg/ml的利福平5ul，然后放入培养箱进行过夜培养16h，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28℃，培养后获得农杆菌菌液，然后将1ml的农杆菌菌液放入50ml LB培养基中，50ml LB培养基中加浓度为50mg/ml的卡那霉素50ul、50mg/ml的利福平50ul，再添加浓度为1mol/L PH5.6的苯磺酸Mes500ul、浓度为1mol/L的乙酰丁香酮AS10ul，再将上述农杆菌菌液放入培养箱中过夜培养，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28℃，过夜培养16‑18h，将过夜培养的菌液在3000r/min，4℃条件下离心20min来收集菌体，然后将菌体重悬于MMA——10mmol/L Mgcl₂,10mmol/L Mes,100umol/L AS，获得菌液重悬液；上述步骤中对农杆菌重悬液进行了优化，分别配制浓度OD₆₀₀为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6的菌液重悬液，将菌液重悬液在侵染前放在暗室静置2‑3h后备用；④、利用高压喷枪系统侵染植物：将步骤③中准备好的菌液重悬液和金刚砂按照3:1的比例混合，然后放入与高压喷枪相连的溶液管中，压力保持在0.1Mpa，高压喷枪的喷头距离叶面15‑20cm，将菌液重悬液垂直喷射在步骤①中制备的烟草苗的叶片上，注意喷洒时喷枪不要距离植物材料太近，以免对植物叶片造成较大的伤害，所述金刚砂借助高压喷枪的压力在叶片上形成微小的伤口，使菌液重悬液携带的病毒载体和外源基因容易侵染植物的叶片，以保证较高的病毒侵染效率和外源基因的表达效率；⑤、侵染后植物材料的培养与观测：将上述步骤④中高压喷枪侵染的植物材料放入光照培养箱进行培养，黑室中，在紫外灯UV照射条件下进行观察，GFP表达的叶片表型为呈现绿色，未表达GFP的叶片呈现红色；上述步骤中对侵染后植物材料的培养温度进行了优化，在光照培养箱分别选择不同的培养温度22℃，25℃，28℃，31℃和34℃进行植物材料的侵染后培养，观察GFP的表达并计算GFP的表达效率表达GFP的烟草植株占总侵染株数的百分比；⑥、GFP的快速表达及检测用Trizol试剂提取表达GFP的植株的总RNA，在RNA水平上进行GFP表达的RT‑PCR检测；利用PBS提取液提取植物总可溶性蛋白，进行GFP表达的Western Blotting检测。