基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法

摘要

本发明公开了一种基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，属于分子计算机技术领域。含有T-T或者C-C错配碱基的双链DNA不能被核酸外切酶III剪切；当存在Hg²⁺或者Ag⁺时，通过T-Hg²⁺-T或者C-Ag⁺-C作用形成3′端完全匹配的双链DNA可被核酸外切酶III剪切，释放出的单链DNA与DNA信号探针1或者DNA信号探针2杂交，导致G-四链体结构的形成或者解体。据此，以Hg²⁺和Ag⁺为输入信号，通过DNA信号探针进行逻辑操作，构建了多种DNA比色逻辑门。

主权项

基于金属离子调控核酸外切酶III剪切作用的DNA比色逻辑门构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：（1）双链DNA模板的构建：DNA 1和DNA 2、DNA 3和DNA 4、DNA 5和DNA 6、DNA 7和DNA 8、DNA 9和DNA 10、DNA 11和DNA 12分别在缓冲溶液1中混合，形成含有T‑T或者C‑C错配碱基的双链DNA模板，退火杂交后，于4 °C保存备用；（2）制备信号探针；富含G碱基的序列G1和G2在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针1；富含G碱基的序列G3和G4以及另外一条序列S在缓冲溶液2中混合，退火杂交后形成信号探针2；（3）G‑四链体结构的形成与解体：取10 μL Hg²⁺或者Ag⁺溶液与20 μL步骤（1）中制备的双链DNA模板溶液反应30分钟，通过T‑Hg²⁺‑T或者C‑Ag⁺‑C作用形成3′端完全匹配的双链DNA；加入10 μL 600 U/mL的核酸外切酶III溶液反应30分钟，核酸外切酶III将金属离子调控的双链DNA剪切为DNA碎片和一条完整的DNA单链；再加入20 μL步骤（2）中制备的信号探针1或者信号探针2，在37 °C水浴中孵育1小时，信号探针1与剪切出的单链DNA杂交形成G‑四链体结构，或者信号探针2与剪切出的单链DNA杂交破坏了信号探针2的G‑四链体结构；（4）显色反应：向步骤（3）制备的G‑四链体溶液中加入含10 μL 2μM氯化血红素的HEPES缓冲溶液，室温下反应1小时，形成G‑四链体‑血红素结构；加入15 μL 3, 3′, 5, 5′‑四甲基联苯胺‑过氧化氢溶液，在G‑四链体‑血红素的催化作用下，3, 3′, 5, 5′‑四甲基联苯胺被氧化，溶液颜色由无色变成蓝色，反应4分钟后，用200 μL 2 M的硫酸终止反应，溶液变为黄色，采用紫外光谱测量吸光度值；（5）DNA逻辑门的构建：取对应的双链DNA模版，以Hg²⁺和Ag⁺为输入，通过T‑Hg²⁺‑T或者C‑Ag⁺‑C作用形成3′端完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA与信号探针1杂交形成G‑四链体结构，进而与氯化血红素结合后形成G‑四链体‑血红素结构，催化3, 3′, 5, 5′‑四甲基联苯胺显色，构建了OR、AND、INHIBIT和XOR逻辑门；取对应的双链DNA模版，以Hg²⁺和Ag⁺为输入，通过T‑Hg²⁺‑T或者C‑Ag⁺‑C作用形成完全匹配的双链DNA，核酸外切酶III剪切双链DNA形成的单链DNA，与信号探针2中的序列S优先杂交，破坏了信号探针2的G‑四链体结构，使其不能与氯化血红素结合，无法催化3, 3′, 5, 5′‑四甲基联苯胺的显色反应，溶液为无色，构建了NOR逻辑门。