一种荷花再生体系的构建方法

摘要

本发明公开了一种荷花再生体系的构建方法。用修枝剪将灭菌的‘广昌白莲’的莲子破壳，取出成熟莲心(胚)作为外植体培养无菌苗；2个月后从无菌苗上切取2-3mm的茎尖、未展开的幼嫩叶片(带有少量叶柄)为外植体诱导愈伤组织；2个月后将愈伤组织诱导分化出芽；1个月后切除底部黑色愈伤，将分化苗增殖；3个月后，将分化苗诱导生根；1个月后将生根的组培苗进行炼苗驯化与移栽。本发明为荷花的转基因技术提供了技术基础；较之前的技术提高了荷花的诱导愈伤率，且愈伤组织个大而稳定；提高了不定芽的繁殖系数；还突破性地以荷花无菌苗的幼嫩叶片为外植体诱导愈伤并成功分化成苗，为荷花诱导愈伤的材料选择拓宽了范围，并提供了材料保障。

主权项

一种荷花再生体系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；(2)无菌苗的培养：用无菌的修枝剪将莲子剪开，取出莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中,每天光照时间为14‑16小时，光照强度1500‑2500Lx，控温25‑28℃，两个月后获得无菌苗；(3)愈伤组织诱导：从无菌苗上切取2‑3mm的茎尖、带有1mm叶柄的未展开的整片幼嫩叶片或5‑8mm的叶柄为外植体，接种到愈伤培养基上培养，接种时使切口处完全与培养基相接，每个培养基接种5‑6个，在黑暗条件下培养，每30天更换新鲜培养基，培养两个月后获得愈伤组织；(4)不定芽分化诱导与增殖：将愈伤组织接到不定芽诱导培养基上，每天光照时间为14小时，光照强度1500‑2500Lx，一个月后分化苗长至1cm时切去下面死去的黑色愈伤，并将分化苗转移至增殖培养基，培养三个月，每30天更换新鲜培养基；(5)分化苗的生根：将分化苗从增殖培养基转移到生根培养基内，每天光照时间为14小时，光照强度1500‑2500Lx，一个月后待小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化；(6)组培苗的炼苗驯化与移栽：将生了根的小苗洗净后，用0.8‑1g/L代森锰锌浸泡半小时，栽至装有灭菌淤泥的塑料盆中，遮阴并覆盖薄膜保湿，4天后昼覆夜敞，15天后完全除掉薄膜；其中，使用的培养基配方如下：无菌苗培养基：MS+6‑BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.8，愈伤诱导培养基：MS+TDZ 0.1‑0.2mg/L+NAA 0.7‑0.8mg/L+蔗糖50g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，不定芽诱导培养基：MS+6‑BA 50‑60μM+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6,增殖培养基：MS+6‑BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6，生根培养基：MS+IBA 1‑2mg/L+蔗糖30g/L,琼脂8g/L,pH＝5.6。