Neues Verfahren zum verbesserten Nachweis Antigen-spezifischer Immunzellen in extrasanguinen Flüssigkeiten

摘要

Neues Verfahren zum verbesserten Nachweis Antigen-spezifischer Immunzellen in extrasanguinen Flüssigkeiten, bestehend aus folgenden Arbeitsschritten: – Isolierung der vitalen Immunzellen aus einer extrasanguinen Flüssigkeit durch geeignete Wasch- und Zentrifugationsschritte (z. B. unter der Verwendung von physiologischer Kochsalzlösung als Waschpuffer und der Zentrifugation bei 200 bis 500 g). – Bestimmung der Gesamtzellzahl (beispielsweise werden je Stimulationsansatz 105 bis 1,5 × 106 Zellen benötigt) – Markierung (Vorfärbung) der isolierten Immunzellen mit einem Fluorochrom-gekoppelten Antikörper, welcher gegen auf den Zellen exprimierte Antigene (z. B. CD45) gerichtet ist oder mittels für die Färbung von vitalen Zellen geeigneten Fluorochromen (z. B. Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester, CFDA-SE) – Entfernung ungebundener Antikörper oder Fluorochrome durch Waschschritte. – Vermischen der vorgefärbten Immunzellen mit heparinisiertem Vollblut (100 μl bis 1500 μl je Stimulationsansatz) derselben Person – Stimulierung der gemischten Proben mit dem interessierenden Antigen, mit oder ohne Zusatz von ko-stimulatorischen Antikörpern anti-CD49d und anti-CD28, anti-CD49d alleine oder anti-CD28 alleine. – Inkubation für 30 min bis 4 h bei 35 bis 39°C und 3 bis 10% CO2. – Zugabe eines Sekretionsinhibitors (z. B. Brefeldin A, Monensin oder andere) – Inkubation für 2 bis 12 Stunden bei 35 bis 39°C und 3 bis 10% CO2. – Lyse von Erythrozyten und Fixierung der Leukozyten – Waschschritte zur Isolierung der Leukozyten – Erhöhung der Zellmembrandurchlässigkeit durch Zugabe einer Zellmembran-Permeabilität-erhöhenden Substanz (z. B. Saponin). – Inkubation mit spezifischen Fluorochrom-markierten Antikörpern zur Identifizierung der Immunzell-Subpopulationen (z. B. anti-CD4 oder anti-CD8) oder gegen Aktivierungsmarker (z. B. anti-CD69, anti-IFN-γ) für mindestens 10 min auf Eis oder bei Raumtemperatur oder bei 35 bis 39°C – Erneute Waschschritte zur Entfernung ungebundener Antikörper – Analyse der Zellen an einem Durchflusszytometer und Diskriminierung der Immunzellen aus extrasanguiner Flüssigkeit von denen aus dem Blut anhand des Fluoreszenzsignals, das zur Vorfärbung verwendet wurde (z. B. Fluorochrom des CD45-Antikörpers, CFSE), wobei die gegen den Stimulus reagierenden Zellen anhand der Positivität in Bezug auf die Aktivierungsmarker von den nicht reagierenden Zellen (Aktivierungsmarker negativ) unterschieden werden.