用于高效基因组编辑的RNA分子的设计、合成及其应用

摘要

在原核生物中，CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeals and CRISPR associated)系统中的cas9蛋白被证实与两种小RNA(crRNA、tracrRNA)结合对外源核酸进行识别直接剪切已达到保护自身的目的。科学家们充分利用这一特性，用cas9和gRNA(将crRNA和tracrRNA融合成一条相对较长的RNA，gRNA)对目的DNA序列进行剪切，从而实现基因定点修饰。然而现有的Cas9/gRNA对靶基因的切割效率较低，一般在5％～30％之间，应用会受到一定的限制。本发明中利用高效筛选体系，筛选出一系列可以提高Cas9活性的gRNA。

主权项

一种RNA，其特征在于序列为5’‑靶序列‑X‑AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU‑3'，其中X表示一段RNA片段，所述X片段具有下图所示的RNA二级结构：其中区域I中所有碱基完全配对，碱基个数为12‑16，A和U的数目之和占总碱基数的50％以上，5’端端点碱基为G或者A，当5’端端点碱基为G时，3’端端点碱基为C或者U，当5’端端点碱基为A时，3’端端点碱基为U；区域II中所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个以上的碱基，靠近3’端的RNA链具有3个以上的碱基，且靠近3’端的RNA链碱基数大于靠近5’端的RNA链碱基数；区域III中一半以上的碱基配对，碱基数为4‑32个；区域IV中碱基可配对也可不配对。