一种枯草芽孢杆菌C3及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法

摘要

本发明名称为一种枯草芽孢杆菌C3及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法，该细菌素作为天然防腐剂适用于低温肉与肉制品、果蔬保鲜，可提高食品的安全性。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C3CGMCC No.9713采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、半制备型反相液相色谱法精细纯化，枯草芽孢杆菌C3细菌素效价提高了32倍，纯度提高了42.80倍。该细菌素对单增李斯特菌有较强抑菌活性，且对热及酸碱稳定性较好，可被蛋白酶K降解，是一种天然安全的生物防腐剂。本发明提供细菌素的生产原料来源广泛，提取工艺简单，纯化方法高效、稳定，适于工业化生产。

主权项

一种利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C3CGMCC No.9713制备抗单增李斯特菌细菌素的方法，其特征在于：(1)枯草芽孢杆菌C3发酵液4℃，10000～11000r/min离心15～20min，去除菌体；(2)采用55％～65％饱和度的硫酸铵沉淀枯草芽孢杆菌C3发酵上清液，4℃静置12h；于4℃，10000～11000r/min离心15～20min，收集沉淀物，用去离子水按发酵液1/10体积的量复溶沉淀；(3)将复溶液分装入预处理的透析袋中，置于去离子水中4℃透析48h除盐，透析液即为细菌素粗提液；(4)细菌素粗提液用0.2μm无菌滤器过滤，采用DEAE‑Sepharose Fast Flow阴离子交换层析法分步洗脱纯化细菌素，层析柱规格为10mm×200mm；缓冲液：A液0.025mol/L pH 7.5Tric‑HCl，B液含有0.4mol/L NaCl的0.025mol/L pH 7.5Tric‑HCl；分步洗脱步骤：50min A液→90min 70％A液+30％B液→40min 50％A液+50％B液→40min 100％B液；流速为1mL/min，上样量5mL，自动收集器5mL/管，收集95～105min具有抑菌活性的洗脱液；(5)将有活性的收集液分装入预处理的透析袋中，4℃去离子水中透析24h除盐；(6)将离子交换透析液用离心真空浓缩仪在10mbar、50℃条件下浓缩，浓缩比为10∶1；(7)离子交换浓缩液经0.2μm无菌滤器过滤，采用半制备型反相液相色谱法线性梯度洗脱纯化细菌素，反相制备柱型号为Agilent ZORBAX 300SB‑C18，柱规格为9.4mm×250mm；流动相：A液为乙腈+0.1％三氟乙酸，B液为水+0.1％三氟乙酸；线性梯度洗脱条件：0～5min，10％～30％A液→5～10min，30％～50％A液→10～55min，50％～90％A→55～60min 90％A；流速4.0mL/min，上样量1mL，1管/min自动收集，收集19～20min具有抑菌活性的洗脱液，真空离心浓缩，去除乙腈，再将其冷冻干燥，干燥后的细菌素纯品呈白色粉末状态。