Procedimiento de genotipado

摘要

Un procedimiento de genotipado de N loci en una molécula de ácido nucleico diana presente en una muestra, en el que N es al menos 1 y cada locus se localiza en una región marcadora del genotipo correspondiente de la molécula de ácido nucleico y corresponde a dos o más genotipos, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) realizar una preamplificación de cada región marcadora del genotipo usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que la amplificación se realiza con un primer grupo de pares de cebadores de amplificación que consiste en un primer conjunto de uno o más cebadores directos y un primer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, dando uno o más amplicones que abarcan la o las regiones marcadoras del genotipo, y en el que cada amplicón contiene una región con al menos una secuencia de nucleótidos que puede actuar como una diana de unión al cebador distinta de la región marcadora del genotipo; b) realizar el o los amplicones de la etapa a) una reacción de amplificación de ácido nucleico a dos niveles usando reacciones enzimáticas dependientes del cebador, en el que b1) el primer nivel es la amplificación de ácido nucleico usando un segundo grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa a), en el que dicho grupo de pares de cebadorES consiste en un segundo conjunto de uno más cebadores directos diferentes y un segundo conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada variante de secuencia de cada locus está dirigido por al menos un cebador de dichos segundos conjuntos de cebadores; formando dicho al menos un cebador un conjunto de cebadores de selección, siendo los cebadores de selección bipartitos que tienen en el extremo 3' una parte de secuencia de reconocimiento del que se une a dichos N loci en la región marcadora del genotipo, y en el extremo 5' una parte de la secuencia marcadora de una pieza artificial que es específica de genotipo o una parte de la secuencia marcadora de dos piezas artificial específica, una pieza de las cuales es específica del genotipo y la otra no es específica del genotipo, y en el que cada cebador de selección que se une al locus diana de la región marcadora de genotipo forma un par de cebadores junto con otro cebador perteneciente a dichos segundos conjuntos de cebadores pero apuntando hacia dicha secuencia de nucleótidos que puede actuar como diana de unión al cebador de la etapa a), y en el que cada cebador de selección está presente en una concentración de menos de 100 nM, preferentemente 10-0,01 nM, y lo más preferido de aproximadamente 0,3 nM, y el otro cebador de dicho par de cebadores está presente a una concentración al menos 100 veces, preferentemente entre 100 y 100 000 veces la de dicho cebador de selección, dando amplicones cada uno de los cuales contiene uno correspondiente de dichos N loci; b2) el segundo nivel es amplificación de ácido nucleico usando un tercer grupo de pares de cebadores que se unen a cada amplicón producido en la etapa b1), en el que dicho grupo de pares de cebadores, presentes en una concentración de al menos 100 veces, preferentemente entre 100 y 100 000 veces la de dichos cebadores de selección en la etapa b1), consiste en un tercer conjunto de uno o más cebadores directos diferentes y un tercer conjunto de uno o más cebadores inversos diferentes, en el que cada parte de la secuencia de marcaje de cada cebador de selección está marcado por el menos un cebador de dicho tercer conjunto de cebadores, formando dicho al menos un conjunto de cebadores de detección, y en el que cada cebador de detección que se une a la parte de la secuencia de marcaje forma un par de cebadores junto con otro cebador que pertenece a dicho tercer conjunto de cebadores pero dirigido a dicha secuencia de nucleótidos que puede actuar como diana de unión del cebador de la etapa a), teniendo los cebadores de detección: i) una secuencia específica de genotipo correspondiente a la parte de la secuencia de marcaje de una pieza artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado con un marcador detectable específico de genotipo; o ii) una secuencia no específica de genotipo que es común a todos los cebadores de detección y corresponde a la secuencia no específica de la parte de la secuencia de marcaje de dos piezas artificial de los cebadores de selección, en el que cada cebador de detección está marcado opcionalmente en el extremo 5' con un marcador detectable o un resto químico; que tiene como resultado amplicones detectables, cada uno de los cuales contiene uno respectivo de dichos N loci marcados con secuencias de marcaje específicas de genotipo y, opcionalmente, marcadores específicos de genotipo; c), el genotipado de dichos N loci de la molécula de ácido nucleico diana mediante: c1) detección durante, o después de, la amplificación de la misma cada marcador comprendido en cada amplicón producido en la etapa b2i), y relacionando la cantidad predominante de marcador detectado con un genotipo específico para cada locus; o c2) después de la amplificación poner en contacto cada amplicón producido en la etapa b2ii) con una matriz de detección de secuencias específicas de genotipo, detectar la hibridación de cada amplicón a la matriz y relacionar la hibridación detectada con un genotipo específico para cada locus.