用于治疗脊髓损伤的重组基因、重组载体和重组细胞

摘要

本发明公开了一种用于治疗脊髓损伤的重组基因，由LIF基因、IRES序列与NT-3基因沿转录方向依次连接而成，或者由NT-3基因、IRES序列与LIF基因沿转录方向依次连接而成。本发明还公开了所述重组基因与基因载体构建而成的用于治疗脊髓损伤的重组载体。本发明所述的重组基因和重组载体，能够同时表达NT-3和LIF，从而针对脊髓损伤的不同发病环节进行治疗，发挥协同作用，从而更好地促进脊髓上下行神经纤维的再生，修复自主运动功能。

主权项

一种用于治疗脊髓损伤的重组载体pIRES2‑LIF/NT‑3的制备方法，包括以下步骤：(1)克隆LIF基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到LIF基因；(2)在LIF基因中引入特异性酶切位点：以LIF基因为模板，用含有EcoRI和BamHI酶切位点序列的LIF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的LIF基因片段；(3)构建重组载体pIRES2‑LIF‑EGFP：用限制性内切酶EcoRI和BamHI，分别酶切pIRES2‑EGFP质粒以及步骤(2)得到的LIF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2‑LIF‑EGFP；(4)克隆NT‑3基因：以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用含有BstXI和NotI酶切粘性末端的NT‑3特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到NT‑3基因片段混合物，其中的一种NT‑3基因片段具有BstXI和NotI酶切粘性末端；(5)构建重组载体pIRES2‑LIF/NT‑3：用限制性内切酶BstXI和NotI酶切步骤(3)得到的重组载体pIRES2‑LIF‑EGFP，将步骤(4)得到的NT‑3基因片段混合物与酶切后线性化的重组载体pIRES2‑LIF‑EGFP混合，采用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体pIRES2‑LIF/NT‑3其中，步骤(1)所述的克隆LIF基因包括以下步骤：A)以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF‑1特异性引物进行PCR扩增，得到含有LIF外显子1的L1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述的LIF‑1特异性引物为：LIF‑1‑5'端引物：5'‑TCTCCCATGCGGCCATTGTTG‑3'，LIF‑1‑3'端引物：5'‑CCTCCCTGCCATCTCCTGTCAGTATC‑3'；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；B)以步骤A)得到的L1基因片段为模板，用LIF‑2特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述的LIF‑2特异性引物为：LIF‑2‑5'端引物：5'‑TTGGCGGCAGGAGTTGTGCC‑3'，LIF‑2‑3'端引物：5'‑CTGGGCTGTGTAATAGAGAATAAAGAGGG‑3'；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；C)以外周血单个核细胞基因组DNA为模板，用LIF‑3特异性引物进行PCR扩增，得到LIF外显子2基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，所述的LIF‑3特异性引物为：LIF‑3‑5'端引物：5'‑CTTTATTCTCTATTACACAGCCCAGG‑3'，LIF‑3‑3'端引物：5'‑CTAGAAGGCCTGGGCCAACACG‑3'；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；D)将步骤B)得到的LIF外显子1基因片段和步骤C)得到的LIF外显子2基因片段混合，在DNA聚合酶的作用下进行重叠延伸PCR反应，得到所述的LIF基因。步骤(2)所述的LIF特异性引物为：LIF上游引物：5'‑CGGAATTCATGAAGGTCTTGGCGGCAGG‑3'，LIF下游引物：5'‑CGGGATCCCTAGAAGGCCTGGGCCAACACG‑3'；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，10个循环；72℃最终延伸5min；步骤(4)所述的NT‑3特异性引物包括NT‑3第一引物对和NT‑3第二引物对，所述的NT‑3第一引物对由NT‑3上游短引物和NT‑3下游短引物组成，所述的NT‑3第二引物对由NT‑3上游长引物和NT‑3下游长引物组成：NT‑3第一引物对为：NT‑3上游短引物：5'‑ATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGC‑3'，NT‑3下游短引物：5'‑GCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTCGAC‑3'；NT‑3第二引物对为：NT‑3上游长引物：5'‑AACCATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTC‑3'，NT‑3下游长引物：5'‑GGCCGCTCATGTTCTTCCGATTT‑3'；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min；杂交PCR的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，16℃保存。