血凝素肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱制备及其应用

摘要

本发明提供了一种高效、特异富集血凝素肽HA标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱及其制备方法和用途，本发明所提供的免疫亲和纯化富集柱包含偶联有免疫亲和纯化的HA特异性多克隆抗体的活化琼脂糖填料和装载该免疫亲和填料的塑料柱。免疫亲和填料偶联的HA特异性多克隆抗体是用免疫亲和法提取得到的，免疫亲和纯化富集柱是将免疫亲和填料装载入特制的塑料柱得到的。该免疫亲和纯化富集柱富集HA标签重组蛋白效率高、特异性强，洗脱条件温和，可重复利用，是目前分离提纯、富集HA标签重组蛋白理想的材料。

主权项

一种血凝素肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于： 1）将免疫亲和纯化的血凝素肽HA特异性多克隆抗体采用流式过柱的化学偶联反应偶联到过碘酸钠氧化的琼脂糖Agarose上，用硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液PBS清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，即得HA标签重组蛋白免疫亲和填料; 2）将HA标签重组蛋白免疫亲和填料装入塑料柱中，按需要的体积装柱，即得所述的HA标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱；所述的免疫亲和纯化的血凝素肽HA特异性多克隆抗体是用HA短肽偶联活化的载体蛋白制得免疫原免疫动物，得到含抗体血清，将含抗体血清上到偶联有HA短肽的免疫亲和层析柱，清洗未结合的杂质，用弱酸洗脱下HA特异性多克隆抗体，脱盐、冻干备用；所述的HA短肽是由9个氨基酸即酪氨酰‑脯氨酰‑酪氨酰‑天冬氨酰‑缬氨酰‑脯氨酰‑天冬氨酰‑酪氨酰‑丙氨酸组成的短肽，采用这9个氨基酸残基分成2组以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的HA短肽，其序列为：1）半胱氨酰‑缬氨酰‑脯氨酰‑天冬氨酰‑酪氨酰‑丙氨酸即C‑VPDYA, 2) 即酪氨酰‑脯氨酰‑酪氨酰‑天冬氨酰‑半胱氨酸 YPYD‑C；所述偶联有HA短肽的免疫亲和层析柱，将2种方向相反巯基化的HA短肽半抗原与碘乙酰化的Agarose反应，形成化学共价键复合体填料HA‑Agarose，将HA‑Agarose装柱即得偶联有HA短肽的免疫亲和层析柱。