一种培养人羊膜间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种培养人羊膜间充质干细胞的方法。它包括如下步骤：取新鲜采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保护液中2-8℃保存备用；取浸泡在羊膜保护液中不超过48小时的人羊膜，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500U/mL和3500-4500U/mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50U注射用两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用，然后分离，培养至细胞融合度达80-90%即得。本发明能避免动物血清及动物来源的试剂带来的潜在的危险性；48小时内均可用于羊膜间充质干细胞的培养，可操作性强；可大大减少因霉菌、厌氧菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。

主权项

一种培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤：    （1）取新鲜采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保护液中2‑8℃保存备用，所述的羊膜保护液是在AIM‑V培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素得到的，其中青霉素钠和硫酸链霉素在羊膜保护液中的终浓度分别为100‑200 U/mL和100‑200 U /mL；   （2）取浸泡在羊膜保护液中不超过48小时的人羊膜，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500‑3500 U /mL和3500‑4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30‑50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用；   （3）将无菌清洗过的人羊膜剪碎，加入AIM‑V培养基，置分离管中用全自动组织分离器进行分离，得羊膜组织匀浆；   （4）将全自动组织分离器处理好的羊膜组织匀浆进行离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基，置于36‑38℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂孵育箱中培养，培养5‑6天后，取出未贴壁的上层置另一新培养瓶中，向原培养瓶和新培养瓶中均加入无血清培养基继续培养，并每隔3‑4天换液一次，待培养10‑15天后，至观察到瓶壁上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得人羊膜间充质干细胞原代细胞混合液，然后经离心，即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞，然后将原培养瓶和新培养瓶中的培养基完全移出，往原培养瓶和新培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液浸没贴壁细胞，放入36～38℃培养箱保温消化7‑9分钟，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，离心弃上清，吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000‑6000个细胞/cm²接种到培养瓶中，并向培养瓶中补充无血清培养基，置36～38℃、饱和湿度，体积分数为5%的CO₂孵育箱中培养，每3‑4天全量换液一次，至贴壁细胞彼此融合，且融合度达80‑90%，即得人羊膜间充质干细胞，在有需要时，可重复上述操作进行多代细胞培养扩增；所述步骤（1）和步骤（2）中的清洗均为0.9%氯化钠注射液清洗。