枇杷液泡转化酶及其编码基因改善烟草糖水平的方法

摘要

一种枇杷液泡转化酶及其编码基因改善烟草糖水平的方法，按如下五个步骤进行：一是分离克隆枇杷液泡转化酶基因的cDNA片段序列，二是分离克隆枇杷液泡转化酶基因的cDNA全长序列，三是枇杷液泡转化酶基因双元表达载体的构建，四是烟草的遗传转化，五是转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定.采用本方法获得的转基因烟草植株生长快，叶片中蔗糖含量明显下降，葡萄糖含量基本不变，果糖含量提高4％-20％，实现了利用液泡转化酶基因调控糖组成及糖水平，改善烟草风味品质的目的，而且利用这种新获得的枇杷液泡转化酶基因，拓宽至用于转接至其它蔬菜、果树和粮食作物，具有有望改善受体作物品质风味的前景。

主权项

一种枇杷液泡转化酶及其编码基因改善烟草糖水平的方法，其特征是按如下步骤进行：（1）分离克隆枇杷液泡转化酶基因的cDNA片段序列：提取枇杷叶片总RNA，反转录合成cDNA，通过与GenBank已知的植物液泡转化酶序列进行比对设计简并引物，利用反转录PCR获得扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到pMD18‑T载体中并测序，利用分子生物学工具分析测序结果，与其他植物液泡转化酶基因比对，确定为枇杷液泡转化酶基因的保守区片段；（2）分离克隆枇杷液泡转化酶基因的cDNA全长序列：根据上述枇杷液泡转化酶基因cDNA片段序列设计引物，通过cDNA末端快速扩增技术获得基因的全长cDNA序列，与其他植物液泡转化酶基因比对，通过分析基因编码区及液泡转化酶特有的功能域确定分离到枇杷液泡转化酶全长cDNA序列，并命名为EJVIN，EJVIN基因编码区核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示；（3）枇杷液泡转化酶基因双元表达载体的构建：根据上述基因EJVIN的完整编码区设计引物，进行PCR扩增，利用无缝克隆技术将扩增产物与经过酶切的植物表达载体pCAMBIA‑1302进行连接，将EJVIN正向插入pCAMBIA‑1302，获得植物过量表达重组双元表达载体，命名为pCAMBIA‑1302‑EJVIN；（4）烟草的遗传转化:将上述表达载体pCAMBIA‑1302‑EJVIN利用农杆菌介导法转化烟草，获得具有特异抗生素抗性的转基因植株，提取转基因植株叶片DNA，利用特异引物进行PCR扩增鉴定，确定成功获得转基因植株，单株收种子,对其后代进行观察鉴定;（5）转基因烟草生长速度和糖分组成水平的试验与测定：将转基因烟草种子进行播种，转基因烟草与未转基因烟草进行生长速度的对比试验；定期采集叶片进行糖含量的高效液相色谱分析。