基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂、制备方法及其应用。本发明中将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。本发明的有益效果在于：其PCR促进剂为蛋白型PCR促进剂，通用性好，活性高，热稳定性好，可以用作各种商品化高保真型DNA聚合酶的促进剂，能提高PCR扩增产量2-6倍，并改善DNA片段有效扩增长度。

主权项

一种基于脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的蛋白型PCR促进剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的重组表达质粒基于嗜热微生物基因组信息，设计其编码的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，在此基础上，修改优化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成技术合成嗜热菌株的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒；(2)重组表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶将构建的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行火球菌脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶诱导表达；(3)亲和纯化表达的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶离心收集诱导表达脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶；(4)检测脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶的酶活性和热稳定性，筛选出蛋白型PCR促进剂将纯化后脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出特异性水解dUTP，不水解dCTP、dTTP、dATP和dGTP；同时其95℃下酶活性半衰期不低于30分钟的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸水解酶作为蛋白型PCR促进剂。