一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。所述ELISA试剂盒包括包被抗原、兔抗鱼IgM二抗、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为鱼类无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为与SEQ ID NO:1至少80%同源的序列；通过鱼特异性IgM的制备、兔抗鱼IgM抗体的制备、抗原的制备、试剂盒组装等步骤制备而成。本发明所述的检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体，具有高特异性。

主权项

一种检测罗非鱼特异无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原、兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为罗非鱼无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为SEQ ID NO:1；该试剂盒是通过以下方法制备而成的：1）罗非鱼特异性抗无乳链球菌IgM的制备：对健康罗非鱼注射1×10⁸ CFU /mL无乳链球菌菌液，攻毒一周后，采集攻毒鱼血清，用IgM纯化试剂盒纯化罗非鱼血清中的特异性抗无乳链球菌IgM；2）兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体的制备：用纯化后的罗非鱼抗无乳链球菌IgM作为抗原注射免疫兔子，共免疫两次，第一次免疫，将0.42 mg的纯化后的罗非鱼抗无乳链球菌IgM稀释至1mL与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合乳化，在兔子背部皮下多点注射免疫；一免两周后二免，免疫的抗原剂量为0.4 mg IgM，与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比混合乳化，二免后一周采集兔抗罗非鱼抗无乳链球菌血清，测血清中的抗体效价；将制备好的兔血清用Protein G亲和层析柱纯化，备用；3）无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原的制备：从罗非鱼无乳链球菌ScpB全长蛋白获取SEQ ID NO:1序列片段；在scpB‑1两端分别加上酶切位点EcoR I和Xho I，将克隆质粒导入表达载体pET32a(+)中，获得重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，0.7mM IPTG诱导重组蛋白表达，经纯化后获得无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原；4）组装试剂盒：将步骤2）中的兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体、步骤3）中的重组蛋白包被抗原、以及HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装成ELISA试剂盒。