一种测定颗粒及薄膜表面对水溶性蛋白非特异吸附的方法

摘要

一种测定颗粒及薄膜表面对水溶性蛋白非特异吸附的方法；用天然或重组表达的水溶性非特异磷酸酯酶、非特异硫酸酯酶为模型蛋白，与颗粒或薄膜类待测试材料在设定pH和温度下进行吸附反应，分离待测试材料，温和洗涤去除弱吸附的蛋白；将吸附了模型蛋白的待测试材料悬浮在含测定模型蛋白酶活性所需显色底物的缓冲液中，在设定条件下反应后，扣除待测试材料测定显色产物的吸收；与吸附反应所用模型蛋白总量进行比较确定吸附率，用于反映其非特异吸附；此方法适用于测定无机颗粒、有机-无机复合颗粒、有机或无机或复合薄膜表面对水溶性蛋白的非特异吸附。

主权项

一种测定颗粒及薄膜表面对水溶性蛋白非特异吸附的方法，其特征在于：(一) 以天然或重组表达的水溶性非特异磷酸酯酶、非特异硫酸酯酶为模型蛋白；此类模型蛋白的代表是牛小肠粘膜碱性磷酸酶、截去膜定位肽段后重组表达的大肠杆菌碱性磷酸酶、绿脓杆菌芳香硫酸酯酶、蜗牛芳香硫酸酯酶，以及重组表达的这些酶的突变体；(二) 用颗粒或薄膜类待测试材料，在设定吸附条件下与模型蛋白进行吸附反应：(1) 设定吸附条件代表是pH在6.0到8.0之间、温度在摄氏4到37度之间；代表性缓冲液包括羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、3‑吗啉丙磺酸缓冲液、2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲液；(2) 模型蛋白的所选浓度水平据需模拟的条件确定，代表水平在0.05mg/L 到5.0g/L之间；(三) 分离吸附了模型蛋白的待测试材料，温和洗涤，测定被吸附模型蛋白的酶活性：(1) 用适当的物理方法分离出微纳米颗粒或薄膜：分离磁性颗粒适当的物理方法包括外部磁力及离心，分离密度较大无机及无机‑有机复合颗粒适当的物理方法包括离心，分离薄膜适当的物理方法包括机械器械辅助的手工分离方法；(2) 温和洗涤：用吸附反应缓冲液温和洗涤吸附了模型蛋白的颗粒及薄膜；(3) 被吸附模型蛋白的催化反应：测定磷酸酯酶活性所用显色底物代表为对硝基苯基磷酸酯和4‑硝基‑1‑萘基磷酸酯、测定硫酸酯酶活性所用显色底物代表为对硝基苯基硫酸酯和4‑硝基‑1‑萘基硫酸酯；测定活性所用缓冲液的代表是模型蛋白发挥酶活性的最适缓冲液，所用显色底物浓度在0.05 到50 mM之间，测定温度在摄氏20到37度之间；反应时间的代表在3.0到60 分钟之间，并根据被吸附模型蛋白的酶活性的高低调整；(4) 终止被吸附模型蛋白的酶反应：如被吸附酶活性很高，在反应设定时间后加入氢氧化钠或氢氧化钾类强碱的高浓度溶液，快速混匀将反应体系pH提高到pH 12以上终止反应，再用适当物理方法除去待测试材料；如被吸附酶活性很低，当所设定反应时间长于30 分钟时，直接用适当物理方法分离除去待测试材料而终止反应；如待测试材料在强碱处理后变化而干扰测定显色产物吸收，用适当物理方法除去待测试材料终止反应；如所用模型蛋白酶活性最适pH低于pH7.0且用物理方法终止了酶反应，则再加强碱将pH调节到pH8.0以上；(5) 用光度计测定吸附酶反应混合物上清液的吸收：显色产物为对硝基苯酚时测定波长在405 nm附近，显色产物为4‑硝基‑1‑萘酚则测定波长在460 nm附近；(四) 以吸附反应所用模型蛋白总量对应酶活性为基数，吸附在待测试材料表面的酶活性活性所占比例为吸附率，表示所测试材料对模型蛋白的非特异吸附性能。