抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，特点是采用甲鱼系统性败血症球状病毒为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到特异鸡卵黄抗体粗提物，纯化后得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体纯品，包括甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备步骤；蛋鸡免疫和收集免疫鸡蛋的步骤；最后分离和纯化得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的步骤，并应用于制备预防和治疗因甲鱼系统性败血症球状病毒引起的相关疾病的药物、保健品或饲料添加剂，优点是该卵黄抗体纯度较高，且对甲鱼系统性败血症球状病毒有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，便于低成本、大批量生产，其制备方法简便易行。

主权项

一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)抗原制备选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原；所述的TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mM Tris‑HCl，200mM NaCl，5mM EDTA，1mM PMSF，所述的TM缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mM Tris‑HCl，10mM MgCl₂，1mM PMSF；(2)动物免疫将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤(1)得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤(1)得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；(3)特异卵黄抗体的分离和纯化将步骤(2)得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的0.05M的pH为5.0的乙酸‑乙酸钠缓冲液，混匀后于4℃冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4℃，10000g的条件下离心20min后取上清液，在上清液中加入饱和的(NH₄)₂SO₄使其终浓度为40％，4℃静置10h，再10000g离心20min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na₂SO₄稀释至100ml，再次于4℃静置10h后，10000g离心20min，沉淀用0.01M的pH为7.2的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。