一种利用免疫芯片检测动物内脏中T-2毒素的方法

摘要

本发明公开一种利用免疫芯片检测动物内脏中T-2毒素的方法，其步骤是：1）将T-2毒素完全抗原点制于芯片上；2）采用竞争法进行免疫芯片技术研究，即检测时将T-2毒素的单抗及标准品（或加标回收样品液）等体积混合后加到芯片上；3）再加入Cy5标记的二抗，形成待测物抗原-单抗-二抗的复合物，荧光信号随小分子浓度的增加而减弱，从而达到检测目的。该方法应用于猪肝中T-2毒素残留，在猪肝中的回收率平均加标回收率均在69.91%～87.80%内，变异系数4.88%～12.56%，芯片免疫分析法简单快速、灵敏度高、高通量、上样量小，适用于动物肝脏中T-2毒素的残留分析。

主权项

一种利用免疫芯片检测猪肝中T‑2毒素的方法，其步骤是：A.T‑2‑HS‑BSA包被原的制备1)T‑2‑HS的制备：将2mg T‑2毒素和42mg琥珀酸酐置于0.8mL吡啶中,在蒸气浴中反应4h,然后将反应混合物于氮气下吹干干燥,再溶于氯仿,用蒸馏水洗4次,将氯仿抽提物蒸发干燥,得T‑2‑HS,用薄层层析TLC法以乙酸乙酯：丙酮：甲醇＝50：50：1为展开剂检测；2)T‑2‑HS‑BSA偶联物的制备将2mg T‑2‑HS用0.2mL二甲基甲酰胺溶解,制得A液；将5mg BSA、3mg碳二亚胺加25mL蒸馏水溶解，制得B液；将A液逐滴加入B液中,边加边搅拌,10min后,加1mg碳二亚胺,20‑30℃、pH值5.5条件下继续搅拌18h,然后用0.01mol·L^‑1,pH值7.2的磷酸缓冲液透析3d,每天换液一次；透析后,分装‑20℃冷冻干燥保存；B.T‑2毒素免疫芯片法标准曲线的建立用点样液将包被原T‑2‑HS‑BSA稀释成1/16mg/mL，每区按3×3点阵于醛基化基片上点样，同时用3％m/VBSA做空白对照，点样后芯片置于37℃培养箱过夜；洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区依次加入1％BSA,30μL/区，37℃湿盒孵育30min；抗原抗体竞争反应：洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区依次加入稀释度为1:400的抗T‑2毒素单克隆抗体，T‑2毒素标品浓度梯度为100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、500pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、1pg/mL，单抗溶液与T‑2毒素标品溶液等体积混合于37℃湿盒预孵育10min，然后每区加入混合液30μL，37℃湿盒孵育30min；洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区加入稀释度依次为1:400的Cy5‑IgG30μL，37℃湿盒孵育30min，洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干备用；使用700microarray laser scanner扫描仪633nm扫描通道进行扫描，再用Software软件进行图像和数据处理，得出标准曲线；C.猪肝中加标回收样品的处理①用绞肉机将猪肝绞碎呈肉糜状，作为样品基质；②将T‑2毒素标品用100％甲醇溶解至1mg/mL，然后用PBS液稀释1000倍作为母液；③称取2.0g样5份，1份作为空白对照不添加母液，其余5份母液添加量分别为5μL、20μL、100μL、200μL，也就是每份样品按照2.5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg来添加，在添加了标品的样品中加5mL的甲醇/水，v/v＝80:20，充分振荡混匀2h,120r/min，28℃，8000r/min离心15min，去上清，2.5mL甲醇/水溶液重复洗涤残渣2次，离心收集上清；④用0.22um的滤膜过滤，得到的滤液用于后续检测；D.免疫芯片法检测猪肝T‑2毒素加标回收样品具体步骤①点样：用点样液将包被原T‑2‑HS‑BSA稀释成1/16mg/mL，每区按2×3点阵于醛基化基片上点样，同时用3％BSA做空白对照，点样后芯片置于37℃培养箱过夜；②封阻：洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区依次加入1％BSA,30μL/区，37℃湿盒孵育30min；③抗原抗体竞争反应：洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区依次加入等体积稀释度为1:400的抗T‑2毒素单克隆抗体和等体积加标回收样品液，混合后37℃湿盒预孵育10min，每区加入体积为30μL，37℃湿盒孵育30min；④加二抗反应：洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干；每区加入稀释度依次为1:400的Cy5标记羊抗鼠IgG 20μL，37℃湿盒孵育30min，洗涤液冲洗基片3次，5min/次，甩干备用；⑤扫描与分析：使用扫描仪扫描，数据用Microsoft Excel软件分析，根据线性方程计算回收率及变异系数；所述的HS是琥珀酸酐。