主权项 |
一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)样品固定:在待测样品中加入终体积浓度为0.5‑1.5%,优选1%的固定剂,避光2‑4小时;(2)样品前处理:吸取至少500µl样品,用无菌水1:8‑1:12,优选1:10稀释后进行超声波处理;(3)样品染色:吸取1ml样品,在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ,避光静置;(4)样品的流式细胞分析:将样品管放置于流式细胞仪的样品台上,通过流式细胞仪对样品进行测试,采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据;其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值,利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来,同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号,将细菌与浮游藻类区分开来,最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小;(5)细菌大小标准曲线的绘制:选取不同粒径规格标准绿色微球,利用流式细胞仪分别进行测试,采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的绿色荧光信号,通过多次测定它们的FSC值,建立细胞粒径与FSC 的关系;(6)数据分析:通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据,利用前向散射光与侧向散射光的不同,排除微型浮游生物对细菌检测的影响;依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱,将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来;根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱,将细菌与浮游藻类区分开来,从而获得目标对象样品中的异养细菌,通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值,再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。 |