枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法

摘要

本发明提供一种枇杷中与木质素代谢相关的乙烯响应因子克隆与转录调控方法，通过从枇杷深度测序的结果中获得乙烯响应因子（ERF）序列片段，乙烯响应因子（ERF）3’末端序列的获得，乙烯响应因子（ERF）在木质素合成代谢中的转录调控方法。本发明利用深度测序的结果，克隆到枇杷中乙烯响应因子（ERF）Unigene的3’末端核甘酸序列，一共获得到32个3’末端序列，并对这些乙烯响应因子在0℃、HT、LTC处理的枇杷果实中ERF表达量的变化，得出与冷害木质化有关的2个ERF基因家族成员，为进一步研究其作用机制、果实采后保鲜技术提供基础理论依据。

主权项

枇杷木质素代谢相关乙烯响应因子克隆与转录调控方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）枇杷乙烯响应因子序列的获得：根据华大公司深度测序返回的结果，一共查找到与乙烯相关的Unigene 约395条，其中与AP2/ERF乙烯响应因子有关的Unigene 共164条，将这164条Unigene 翻译的蛋白序列在NCBI中进行蛋白序列的比对，筛选出含有AP2结构域的Unigene32条；（2）乙烯响应因子3’末端序列的获得：参照Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification试剂盒说明书，合成3’cDNA模板并根据说明书要求设计相应基因的特异3’末端上游引物，分别为内侧引物、外侧引物，内侧引物序列见SEQ ID NO:1‑32，外侧引物序列SEQ ID NO:33‑64，下游引物参照试剂盒说明书提供的通用引物UPM和 NUP，对3’cDNA模板进行2次PCR，第二次PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与pMD18‑T载体过夜连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，用100mg/ml青霉素的LB板上筛选阳性克隆，并对筛选出的阳性克隆进一步用载体引物进行菌落PCR确定后测序，一共得到32条乙烯响应因子相关基因的3’末端序列；（3）枇杷果实的RNA的提取采用CTAB法提取，粗提的RNA用TURBO DNase去除其中的DNA，取1 μl去DNA的RNA用Nanophotometer Pearl定量后，取3 μg用RevertAid™ First Strand cDNA试剂盒逆转录成cDNA，用于定量PCR；（4）枇杷果实处理：以冷敏性红肉枇杷洛阳青为材料进行以下3个处理：直接0℃贮藏；热激处理，即40℃ 4小时后转入0℃贮藏；程序降温，即5℃ 6天后转入0℃贮藏；检测3个处理过程中硬度、木质素含量的变化情况；（5）对筛选出的32个乙烯响应因子用在线网站 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/设计定量PCR的引物，上游引物序列见SEQ ID NO:65‑96，下游引物序列见SEQ ID NO:97‑128，以枇杷管家基因Actin作为内参基因，其引物序列见SEQ ID NO:129和130，处理前的起始点表达量为1，计算方法采用△△C_t相对定量的方法计算3个处理过程中乙烯响应因子的表达量；（6）结合红肉枇杷洛阳青果实贮藏的3个处理中的硬度、木质素含量的变化情况以及ERF基因的表达情况，筛选出2个与枇杷果实木质化进程有一定相关性的乙烯响应因子，分别为SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132；所述3个处理同步骤（4），是指0℃、热激、程序降温；其中步骤（2）所述二次PCR的第一次反应参数为：10×ExBuffer 2 μL，2.5mmol/L dNTPs 1.6 μl，下游通用引物UPM 2 μL，10μmol/L上游外侧引物0.5 μl，ExTaq聚合酶0.1 μL，加灭菌的双蒸水至20 μL，Touchdown PCR反应条件为: 反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，72℃，150 s，5个循环；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸150 s，5个循环；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸150 s，25个循环；最后72℃延伸10 min；第二次反应参数为：10×ExBuffer 2 μL，2.5mmol/L dNTPs 1.6 μl,下游通用引物NUP 2μL，10μmol/L上游内侧引物0.5 μl,ExTaq聚合酶0.1 μL，加灭菌的双蒸水至20 μL，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。