应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法

摘要

本发明涉及一种应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法。该方法包括应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将含有外源基因的表达载体或外源基因的mRNA导入猪T淋巴细胞中，转染后的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪T淋巴细胞。本发明的方法转染效率高，操作简便，所需质粒量少，目的基因表达迅速，有利于研究T细胞激活、效应阶段的特异性基因功能。

主权项

应用核转染法体外转染猪T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：应用电穿孔技术及细胞特异性的细胞核转染液将GFP mRNA导入猪外周血单核细胞(PBMC)中，转染后的细胞经过培养、分选出表达外源基因的猪PBMC，所述猪PBMC在所述细胞特异性的细胞核转染液中的浓度为3×10⁶/100μl鼠T细胞转染液，每3×10⁶所述猪PBMC加入10μg或20μgGFP mRNA；其中，所述的猪PBMC是初始的猪PBMC或激活的猪PBMC；所述激活的猪PBMC为将3×10⁶/ml PBMCs用2μg/ml刀豆蛋白A进行激活两天得到；所述的核转染法使用质粒介导；其中，所述质粒介导的核转染法的操作步骤如下：(1)pMaxGFP(AMAXA)质粒的大量提取：按照OMEGA公司生产的E.Z.N.A.TM Endo‑Free Plasmid Maxi Kit说明书进行，质粒提取完成后，用分光光度计测定质粒的浓度；(2)猪外周血单个核细胞(PBMC)的提取：从猪的前腔静脉无菌采取20ml肝素钠抗凝血，经PBS等体积稀释、混匀后，将其缓慢加于等体积的猪淋巴细胞分离液上，水平转子离心1800rpm，20min，之后吸取血浆下的淋巴细胞层，获得PBMC；(3)猪外周血PBMC的转染：细胞计数后，将5×10⁶未激活的或激活的PMBC溶于100μl恢复至室温的鼠淋巴细胞转染缓冲液中，加入4μg pMaxGFP，同时设立不加质粒的阴性组，轻轻混匀后转移到2mm核转杯中；将核转杯放入核转仪中，用核转仪中的固有程序X001和Z001程序分别进行转染初始T细胞，X001和Z001程序分别进行转染激活的T细胞，然后迅速将细胞转移至2ml37℃预热的完全1640培养基中，并置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养；激活的PMBC：先将3×10⁶/ml PBMCs经2μg/ml conA刺激两天；(4)T细胞转染效率和细胞成活率的检测：转染24h后，将细胞从细胞板小心吸出，离心沉淀，并计数；然后取1×10⁶细胞进行染色：将10⁶细胞悬于100μl含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS的染色缓冲液中，加入0.2μg荧光素PE标记的鼠抗猪CD3ε抗体，混匀后置于冰上反应20分钟；之后用PBS清洗三遍，洗去未结合抗体；最后一遍洗涤后再将细胞悬于100μ1染色缓冲液，加入0.25μg 7‑AAD，混匀后置于冰上反应10分钟；反应后直接加入适量PBS，用流式细胞仪检测细胞的成活率和T细胞的转染率。