用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，提取DNA样本并进行PCR反应。本发明采用特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；利用MGB Blocker阻滞NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高灵敏度，大于ARMS的1%；可在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。

主权项

一种用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型；所述的KRAS外显子2的12，13 外显子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K35‑1B       5‑ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA‑3             SEQ ID NO.01K35‑3B       5‑ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT‑3             SEQ ID NO.02K35‑2B       5‑CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC‑3              SEQ ID NO.03K34‑2B       5‑AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC‑3             SEQ ID NO.04K34‑1B       5‑AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA‑3            SEQ ID NO.05K34‑3B       5‑AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT‑3             SEQ ID NO.06K38‑1B‑1     5‑TGGTGGTTGGAGCAGGTGA‑3               SEQ ID NO.07K38‑2B‑1     5‑GGTGGTTGGAGCAGGTGC‑3                SEQ ID NO.08K38‑3B‑1     5‑TGGTGGTTGGAGCAGGTGT‑3               SEQ ID NO.09K37‑1B       5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA‑3              SEQ ID NO.10K37‑2B       5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC‑3              SEQ ID NO.11K37‑3B       5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT‑3              SEQ ID NO.12KWT34MGB     5‑GGAGCTGGTGGCGTAG‑3‑MGB           SEQ ID NO.13KR‑R         5‑AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT‑3          SEQ ID NO.14KR‑Taqman   FAM‑5‑ CAAGAGTGCCTTGACGATAC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO.15；所述的KRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K181‑1B       5‑GATATTCTCGACACAGCAGGTA‑3        SEQ ID NO.16K181‑2B       5‑ATATTCTCGACACAGCAGGTG‑3         SEQ ID NO.17K182‑1B       5‑TCTCGACACAGCAGGTCC‑3            SEQ ID NO.18K182‑2B       5‑TCTCGACACAGCAGGTCG‑3            SEQ ID NO.19K182‑3B       5‑ATTCTCGACACAGCAGGTCT‑3          SEQ ID NO.20K183‑1B       5‑TCTCGACACAGCAGGTCAC‑3           SEQ ID NO.21K183‑2B       5‑TCTCGACACAGCAGGTCAT‑3           SEQ ID NO.22K181R         5‑AATACACAAAGAAAGCCCTCCC‑3        SEQ ID NO.23K181WTMGB   5‑GACACAGCAGGTCAAGAGG‑3‑MGB         SEQ ID NO.24K181taqman  FAM‑5‑AATGAGGGACCAGTACATG‑3‑BHQ‑MGB   SEQ ID NO.25；所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物,FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K349‑1B‑1      5‑ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG‑3                 SEQ ID NO.26K350‑1B‑1      5‑ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG‑3          SEQ ID NO.27K351‑1B‑1      5‑CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC‑3           SEQ ID NO.28K351‑2B‑1      5‑CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT‑3           SEQ ID NO.29K349R          5‑ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT‑3            SEQ ID NO.30KWT349MGB1  5‑GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA‑3‑MGB        SEQ ID NO.31K349Taqman  FAM‑5‑ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG‑3‑BHQ‑MGB  SEQ ID NO.32；所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针体为：K436‑1B       5‑GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT‑3           SEQ ID NO.33K436‑2B       5‑TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG‑3             SEQ ID NO.34K437‑1B       5‑TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC‑3           SEQ ID NO.35K437‑2B       5‑TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA‑3           SEQ ID NO.36K436R         5‑TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC‑3          SEQ ID NO.37KWT436MGB   5‑CTGTCTTGTCTTTGCTGATG‑3‑MGB           SEQ ID NO.38K436Taqman  FAM‑5‑ ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO.39；所述的NRAS外显子2的12，13 编码子位点点突变引物,FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：N34‑1B          5‑TGGTGGTGGTTGGAGCAA‑3              SEQ ID NO.40N34‑2B          5‑TGGTGGTGGTTGGAGCAC‑3              SEQ ID NO.41N34‑3B          5‑TGGTGGTGGTTGGAGCAT‑3              SEQ ID NO.42N35‑1B          5‑GGTGGTGGTTGGAGCAGA‑3              SEQ ID NO.43N35‑2B          5‑GGTGGTGGTTGGAGCAGC‑3              SEQ ID NO.44N35‑3B          5‑GGTGGTGGTTGGAGCAGT‑3              SEQ ID NO.45N37‑1B          5‑GTGGTGGTTGGAGCAGGTA‑3             SEQ ID NO.46N37‑2B          5‑GGTGGTTGGAGCAGGTC‑3               SEQ ID NO.47N37‑3B          5‑GTGGTGGTTGGAGCAGGTT‑3             SEQ ID NO.48N38‑1B          5‑GGTGGTTGGAGCAGGTGA‑3              SEQ ID NO.49N38‑2B          5‑GTGGTTGGAGCAGGTGC‑3               SEQ ID NO.50N38‑3B          5‑GGTGGTTGGAGCAGGTGT‑3              SEQ ID NO.51N34R            5‑CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT‑3        SEQ ID NO.52N34taqman       FAM‑5‑ AAGCGCACTGACAATCC‑3‑BHQ‑MGB  SEQ ID NO.53NWT34MGB        5‑GTTGGAGCAGGTGGTGTTG‑3‑MGB       SEQ ID NO.54；所述的NRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：N181R            5‑ATGGCAAATACACAGAGGAAGC‑3          SEQ ID NO.55N181‑1B          5‑GACATACTGGATACAGCTGGAA‑3          SEQ ID NO.56N181‑2B          5‑GACATACTGGATACAGCTGGAG‑3          SEQ ID NO.57N181‑3B          5‑GACATACTGGATACAGCTGGAT‑3          SEQ ID NO.58N182‑1B          5‑CATACTGGATACAGCTGGACC‑3           SEQ ID NO.59N182‑2B          5‑ATACTGGATACAGCTGGACG‑3            SEQ ID NO.60N182‑3B          5‑ACATACTGGATACAGCTGGACT‑3           SEQ ID NO.61N183‑1B          5‑CATACTGGATACAGCTGGACAC‑3           SEQ ID NO.62N183‑2B          5‑CATACTGGATACAGCTGGACAT‑3           SEQ ID NO.63N181Taqman     FAM‑5‑ AATACATGAGGACAGGCG‑3‑BHQ‑MGB  SEQ ID NO.64NWT181MGB      5‑GATACAGCTGGACAAGAAGAG‑3‑MGB      SEQ ID NO.65；所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：N436‑1B          5‑ATTCCATTCATTGAAACCTCAA‑3          SEQ ID NO.66N437‑1B          5‑ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT‑3         SEQ ID NO.67NWT436MGB        5‑ATTGAAACCTCAGCCAAGAC‑3‑MGB     SEQ ID NO.68N436R            5‑GAATATGGATCACATCTCTACCAG‑3        SEQ ID NO.60N436Taqman    FAM‑5‑ACAGCTTTCAGCATTTGTG‑3‑BHQ‑MGB  SEQ ID NO.70。