一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试纸条

摘要

本发明公开了一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的免疫胶体金试纸条及其制备方法。将纯化的CGMMV多克隆抗体溶液点在硝酸纤维素膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维素膜的质控线上；分别将吸水滤纸制成的样品垫、CGMMV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴到一张带不干胶的PVC胶板上，制成试纸条。本发明的试纸条可检测出葫芦科植物中的CGMMV，适用于由CGMMV引起的病毒病检测和诊断。该方法简便、快速、成本低廉， 5-10分钟即出结果，便可肉眼直接观察。适用于基层各级农业部门、农户和出入境检验部门开展病害的快速大量筛选检测，有助于及时有效的控制和扑灭疫情，具有广阔的应用前景。

主权项

一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒 CGMMV 的试纸条，由标记好质控线和检测线的硝酸纤维素膜、样品垫、免疫胶体金垫、吸水纸和 PVC 胶板构成，依次将样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸贴到一张带不干胶的 PVC 胶板上， 确保接头处有叠压， 使层析能顺利进行；其中所述的质控线的成分是羊抗兔多克隆抗体，检测线的成分是纯化的 CGMMV多克隆抗体；所述的免疫胶体金垫是载有胶体金标记的 CGMMV 多克隆抗体的玻璃纤维 ；所述的 CGMMV 多克隆抗体是 CGMMV 外壳蛋白经原核可溶表达、并纯化浓缩后注射大耳白兔获得的 CGMMV多克隆抗体；包括以下步骤 ：（1）CGMMV 多克隆抗体的制备：通过同源克隆方法获得 CGMMV 外壳蛋白基因，构建CGMMV‑pET32aCP 原核表达载体， 转化大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS菌株，在 0.1  mmol/L 的IPTG 终浓度、23 ℃恒温、90 rpm 摇床转速下诱导 25 小时， 获得 CGMMV‑CP 外源融合蛋白的可溶表达，将表达上清用 Ni 琼脂糖凝胶 FF 柱纯化，经超滤离心管离心浓缩目的蛋白，以纯化蛋白为抗原注射大耳白兔，采血，取血清，提纯抗体 IgG，纯度不小于95%；（2）胶体金溶液：将 100 mL 0.01% 氯化金用2‑3 mL 的 1% 柠檬三钠还原成15 nm‑60 nm 的胶体金颗粒溶液；（3）CGMMV 免疫胶体金溶液：用0.1 mol/L K2CO3 将胶体金溶液pH 值调至7‑8.5，将胶体金溶液按100 mL 胶体金溶液中加入0.5 mg‑2 mg步骤（1）的CGMMV 多克隆抗体，混合均匀，再加入10%BSA至终浓度为0.5‑2%进行封闭， 12000rpm离心20min， 去上清， 取沉淀即获得 CGMMV 免疫胶体金溶液 ；（4） 将上述的CGMMV免疫胶体金溶液用PBS缓冲液进行稀释到工作浓度， 并加入5‑25%的蔗糖， 混匀后用喷金机喷涂到聚酯膜或玻璃纤维标记垫介质上， 形成 CGMMV 免疫胶体金垫 ；（5） 将CGMMV多克隆抗体用0.01M的PBS溶液进行稀释到工作浓度， 加入2%的蔗糖， 用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线上， 羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维素膜质控线上 ；（6）将吸水滤纸制成的样品垫、 CGMMV 免疫胶体金垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴到一张带不干胶的PVC胶板上， 并贴上带有插入液体面最高限位的指示线MAX的胶带， 然后切割成试纸条 ；（7）将组装好的试纸条密封包装保存。