一种结核分枝杆菌菌体发酵的方法

摘要

本发明涉及结核分枝杆菌的发酵方法，属于生物发酵领域。本发明提供了一种全新的结核分枝杆菌发酵方法，通过菌株的一级扩增、二级扩增、一级发酵、二级发酵最终实现了结核分枝杆菌菌浓超高、目的蛋白大量表达的结果。获得全新的结核分枝杆菌的发酵方法，发酵收率不低于12g/L，而且菌体中总的rTPA38目的蛋白可达15%以上，活性也较高，这些都是现有技术无法达到的。菌体发酵的批量大，一次性可发酵10L至200L，收菌速度快，生产效率高。

主权项

结核分枝杆菌菌体发酵的方法，包括以下步骤：一、一级扩增液制备：取结核分枝杆菌斜面单菌落，置于含有3mL扩增培养基的试管中，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养过夜；在超净工作台中向含有8mL扩增培养基的三角瓶中加入50mg/mL氨苄青霉素8μl，然后接种80μl试管中的菌种，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养10‑12h后，取样，至OD₆₀₀值约为1即可停止培养；二、二级扩增液：接种前，在超净工作台中向2瓶含有500mL扩增培养基的三角瓶中加入50mg/mL氨苄青霉素500μl，然后取一级扩增液5mL接种到二级扩增培养基中，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养12‑14h后，取样，至OD₆₀₀值约为1.5即可；三、一级发酵培养：(1)接种前设定通气为2500L/h，罐压为0.04Mp，搅拌速度为560rpm，温度为37℃时的溶解氧为100％；(2)接种前工作：连接500mL浓度为28％浓氨溶液补料瓶以及500mL浓度10％稀盐酸溶液补料瓶，调节培养基的pH至6.8‑7.0；(3)接种：以5％‑7％的接种量接种到种子罐内的10L发酵培养基中；(4)发酵培养：培养温度37±1℃，初始搅拌速度为100rpm,通气量为300L/h,罐压0.02‑0.04Mpa，pH6.8‑7.0,培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定35％，控制在30％‑40％之间，溶氧与转速偶联，若溶氧低于30％，加大通气量，培养2‑4h至OD₆₀₀2～3，培养过程中每隔半小时测定发酵液的OD₆₀₀值；四、二级发酵培养：(1)接种前设定通气为16m³/h，罐压为0.04Mp，搅拌速度为400rpm，温度为37±1℃时的溶解氧为100％；(2)接种前工作：连接500mL浓度为28％浓氨溶液补料瓶、500mL浓度10％稀HCl溶液补料瓶、4L80％碳源补料瓶；(3)接种：将一级发酵后的OD₆₀₀符合要求的种子液以5‑10％的接种量接种到发酵罐内120L发酵培养基中；(4)发酵培养：初始搅拌速度为100rpm,通气量为1.8m³/h,pH6.8‑7.0,37±1℃培养，溶解氧下降至35％后，设定DO为35％与转速关联控制，控制在30％‑40％，若关联控制溶氧低于30％，取消关联，调转速及逐渐调大通气量，最大可调至16m³/h，培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸溶液以调节pH；当OD₆₀₀≥3时，溶解氧设定值为15％，调节转速控制溶氧在10％‑20％，通气量不变，当DO显著上升时,以碳源限制模式流加入灭菌的80％碳源，37±1℃继续连续通气培养4至5小时后OD₆₀₀≥8收菌，培养过程中每隔约半小时测定发酵液的OD₆₀₀值；收菌：采用管式高速离心机以45Hz频率、14000rpm进行离心菌液弃上清液，流速为1.4‑1.8L/min，将菌体收集存放于洁净容器中，即得到发酵好的目的菌体；五、培养基配制如下：(1)结核分枝杆菌扩增培养基为罗氏鸡蛋斜面培养基，购买自罗氏公司；(2)发酵培养基1000mL：硒酸钠10mg，磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸0.6g，天门冬素3.6g，甘油20mL，马铃薯淀粉40g，新鲜鸡卵液930mL，谷氨酸钠0.15g，余量为水；(3)其它补料液的配制：稀盐酸溶液分装1000mL：取稀盐酸HCl 1000mL各分装500mL入2个500mL已灭菌补料瓶中，浓氨溶液分装1000mL：取浓氨溶液1000mL各分装500mL入2个500mL已灭菌补料瓶中；80％碳源配制：称取甘油6400g溶于纯化水中至总体积为8L，分装入5L补料瓶中，每瓶4L，121℃灭菌20min，冷却后常温密闭存放；50mg/mL氨苄青霉素10mL：称取1g氨苄青霉素用20mL纯化水溶解；在超净工作台中，用无菌针头过滤器过滤除菌，分装入已灭菌容器中，分装规格为1mL/1.5ml EP管，共10管，2‑8℃冰箱中保存待用。