贻贝蛋白降压肽的快速制备方法

摘要

本发明公开了一种贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，该降压肽的氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp（VSWPCRW），ESI-MS测定分子量为935.07Da。贻贝经去壳取肉、酶解、超滤、琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制（RP-HPLC）纯化，得活性肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp。本发明制备的活性肽具有显著的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，可用于高血压治疗相关的药物。

主权项

贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）琼脂糖磁性微球的制备与活化：按照重量体积比1 ~ 1.5g : 30 mL将琼脂糖加入到水中，共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入1 ml Fe₃O₄磁流体，在旋涡混合器上充分混合；在搅拌下将混合液滴入到80℃的有机相中，并在80℃下反应15 ~ 20 min；有机相冷却至40℃于250 rpm转速机械搅拌10 ~ 15 min使微球成形，并在磁场中分离，制得的微球分别用石油醚和去离子水清洗3次，以清除残余有机相，得琼脂糖磁性微球；将NaBH₄按照重量体积比2 ~ 3mg : 1mL加入到0.8 ~ 1.0 mol/L的 NaOH溶液中，然后将环氧氯丙烷按照体积比0.5 ~ 0.7 : 1再加入到0.8 ~ 1.0 mol/L 的NaOH溶液中，最后按照重量体积比2 ~ 3 g : 1 mL将琼脂糖磁性微球加入到0.8 ~ 1.0 mol/L的 NaOH溶液中，于40℃下搅拌3~5 h，得活化琼脂糖磁性微球；2）ACE的固定：按照质量比1 ~ 1.5 : 10将血管紧张素转化酶和活化的琼脂糖磁性微球加入0.1 mol/L的硼酸盐缓冲液中，40~50℃振荡2~ 3 h后，混合液放入磁场中，将琼脂糖磁性微球分离出来，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE；3）贻贝蛋白的酶解和超滤：将贻贝去壳，贻贝肉与甘氨酸‑NaOH缓冲液按照1g：3mL ~1g：5mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH 值至9. 5 ~ 10，得混合液；将所述的混合液调温度至45 ~ 55℃，按照贻贝肉质量的0.5 ~ 0.8%加入碱性蛋白酶，酶解4 ~ 6 h；然后将酶解液升温至90 ~ 95℃，并保持10 ~ 15min；将酶解液调温度至35 ~ 40℃，用0.1 mol/L NaOH溶液调pH至8.5 ~ 9.0，按照贻贝肉质量的0.8 ~ 1.0%加入胰蛋白酶，酶解4 ~ 6 h后，将酶解液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，冻干，即为超滤酶解物；4）贻贝蛋白降压肽的制备：将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制纯化，得降压肽。