杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法

摘要

杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）杜鹃红山茶无菌苗的获得；2） 叶片的愈伤组织诱导与继代；3）愈伤组织不定芽的分化及植株再生；4）再生植株的生根及驯化移栽。本发明利用杜鹃红山茶无菌苗叶片进行愈伤组织诱导，在对愈伤组织进行状态调整的基础上，利用特定激素配比的MS培养基进行不定芽分化，最后利用“滤纸桥生根法”解决山茶难以生根的技术难题，从而实现杜鹃红山茶叶片愈伤组织诱导及植株的再生，培养周期短，繁殖系数高，为山茶分子育种奠定了基础。

主权项

杜鹃红山茶叶片愈伤组织再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：1）杜鹃红山茶无菌苗的获得a、外植体的选取与预处理3月中旬，剪取杜鹃红山茶嫩梢茎段，去除叶片后消毒处理后，备用；b、茎段初代培养与增殖扩繁将消毒完毕的茎段切为带至少一个腋芽的茎段，接种于茎段培初代培养基中培养，培养至茎段长出2～4cm的嫩芽，再将其切成单芽苗，接种于茎段继代培养基中培养，培养得到3～4cm成型的丛生芽条，丛生芽条每50±5d进行一次继代培养，获得大量杜鹃红山茶无菌苗；所述的茎段培初代培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.3mg/L NAA+4～6mg/L6‑BA+0.04～0.06%PVP+45～55mL/L CW ；所述的茎段继代培养基为MS+35～45g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.3mg/L NAA+1～3mg/L 6‑BA+1～3mg/L2‑ip+45～55mL/L CW；2） 叶片的愈伤组织诱导与继代培养选取生长状态良好的成型无菌苗，切取叶片，接种于愈伤诱导培养基中，培养35～45d后将叶片切口及叶脉出长出淡黄色、细颗粒愈伤组织转接至愈伤组织继代培养基中，每45±5d转接一次，进行继代培养；所述的愈伤诱导培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.4～0.6mg/L2,4‑D+45～55mL/L CW；所述的愈伤组织继代培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.4～0.6mg/L TDZ+90～110ml/L CW；3）愈伤组织不定芽的分化及植株再生经过2～3次继代培养后，选取黄绿色、细颗粒愈伤组织，转接于不定芽分化培养基中，培养35±5d，得到成型芽条；所述的不定芽分化培养基为MS+25～35g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.15mg/L NAA+8～12mg/L6‑BA+90～110mL/L CW+450～550 mL/L脯氨酸+90～110mL/L谷氨酰胺；4）再生植株的生根及驯化移栽待成型芽条长至2～3cm后，采用“滤纸桥生根法”，弱光培养50d后即可获得生根的再生植株。