一种高效重组表达透明质酸酶的方法

摘要

本发明公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过在重组透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达，活性达到了21333.33U/mL。本发明所构建的重组毕赤酵母工程菌株，具有非常大的应用前景。本发明所提出的提高透明质酸酶高效表达制备的方法，进一步降低了透明质酸酶的生产成本，为工业化生产奠定了基础。

主权项

一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，是在SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因的N端添加一段SEQ ID NO.1所示的核苷酸，构建重组质粒pPIC9K‑His‑HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达；所述构建重组质粒pPIC9K‑His‑HaseA3887，是全化学合成SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因，以此为模版，设计引物，在上下游引物分别引入限制性内切酶位点，选取上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为NotI，使用该对引物扩增SEQ ID NO.2所示的透明质酸酶基因，对扩增获得的透明质酸酶基因片段进行EcoRI和NotI双酶切，连接至经EcoRI、NotI双酶切后的表达载体上pPIC9K上；所述上游引物的核苷酸序列为:5’‑CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC‑3’；下游引物的核苷酸序列为:5’‑TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC‑3’。