一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法

摘要

本发明公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。

主权项

一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法，其特征在于：包括如下步骤：一、多能性转录因子的克隆①总RNA提取利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取步骤为：(1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50‑100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1.5mL EP管中，并分别快速加入1mL的Trizol，混匀后室温静止10分钟；(2)用标准为4℃、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加200μL氯仿用力反复摇晃15s，25℃下放置3min后用同样标准离心15min；(3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400μL异丙醇，混匀，室温放置15min，然后以相同标准离心10min；(4)弃上清液，加1mL用DEPC水处理的75％乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心5min；(5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20μL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将RNA完全溶解，并分装后‑80℃保存；②RT‑PCR反应将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保真primer star mix酶、上下游引物，克隆Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc多能性转录因子的编码序列，其中，扩增体系为：模板1ul，上下游引物各1ul，酶12.5ul，d₂H₂O 9.5ul；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性1min，退火30sec,其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c‑Myc退火温度为60℃，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；③克隆产物与T载体连接扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与pMD19‑T simple克隆载体连接：条件为16℃，16h；④感受态细胞的制备及转化(1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至OD600值0.5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min，在4℃，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0.1mol/LCaCl2 10mL重悬沉淀，冰上放置30min；4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2和80％甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后‑70℃保存备用；(2)转化：取制备好的感受态细胞DH5α，迅速放于冰上融化，将10μL连接反应产物加入200μL的感受态细胞中，轻轻旋转以混匀，冰中放置45min；42℃热激45‑90s，快速将离心管转移到冰浴中，细胞冷却2‑3min；每管加入800μL LB液体培养基，于37℃轻微振荡培养1h；超净台中将200μL菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，均匀涂板，37℃恒温培养12‑16h；⑤菌液PCR、单双酶切、测序鉴定挑取平板上的阳性菌落，将单菌落接种到含氨苄青霉素的1ml LB培养基中，180rpm摇床培养4‑6h，吸取菌液进行PCR检测，反应体系如下：菌液模板1μL,rTaq酶0.5μL,dNTP 2μL,10×buffer 2μL,Primer F 1μL,Primer R 1μL,d₂H₂O 12.5μL,总体积20μL；反应条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c‑Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；将菌液PCR鉴定正确的条带，根据转录因子各自引入的酶切位点，分别采用EcoR I、XhoI、XbaI进行单酶切与双酶切，将酶切鉴定正确的进行测序，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19‑T‑Oct4、pMD19‑T‑Sox2、pMD19‑T‑Klf4和pMD19‑T‑c‑Myc；二、真核表达载体的构建用EcoRI和XhoI限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19‑T‑Oct4、pMD19‑T‑Sox2、pMD19‑T‑c‑Myc质粒，用EcoRI和Hind III限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19‑T‑Klf4质粒，胶回收目的片段，同时用相对应的限制性内切酶双切pcDNA3.0载体，胶回收目的载体，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、单双酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pcDNA3.0‑Oct4、pcDNA3.0‑Sox2、pcDNA3.0‑Klf4和pcDNA3.0‑c‑Myc，并进行测序鉴定；三、体外转录①质粒准备将测序正确的pcDNA3.0‑Oct4、pcDNA3.0‑Sox2、pcDNA3.0‑Klf4、pcDNA3.0‑c‑Myc和pcDNA3.0‑EGFP重组质粒按照1：1000的比例接种到10ml含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养14‑16h，待菌液浑浊、发白，且OD值约为0.6时，4℃、8000rpm离心3min收集菌体，利用质粒小提试剂盒进行小提；②质粒线性化利用XhoI、XbaI限制性内切酶进行线性化处理，线性化条件为37℃水浴3h，利用DNA纯化试剂盒对线性化处理后的产物进行纯化，最终获得各质粒的浓度范围为：200‑500ng/uL；③体外转录利用mMESSAGET7 Ultra Kit试剂盒对纯化产物进行体外转录，将mMESSAGET7 Ultra Kit中的试剂置于冰上解冻，以下步骤均在冰上操作：(1)mRNA“加帽”在PCR管中依次加入以下试剂：T7 2×NTP/ARCA 10uL,10×T7 Reaction Buffer 2uL,linear template DNA 0.1‑1uG,T7 Enzyme Mix 2uL,并用无核酸酶的水补充至20uL，温和的混合上述反应溶液，在37℃条件下水浴2h；向上述PCR管中添加1uL TURBO DNase，混合均匀，37℃条件下水浴15min；(2)mRNA“加尾”在PCR管中依次加入以下试剂：上述混合物20uL，Nuclease‑free Water 36uL，5×E‑PAP Buffer 20uL，25mM MnCl2，10uL，ATP Solution 10uL，总体积96uL；向上述管中添加4ul E‑PAP，轻轻混合，终体积为100ul，并在37℃条件下水浴30‑45min；(3)mRNA纯化对“加尾”和“加帽”处理后的mRNA利用MEGAclear^TMKit进行mRNA纯化，收集纯化后的mRNA，利用NANO DROP分光光度仪检测其浓度和OD值，最终获得各mRNA的浓度范围为：100‑500ng/uL；四、山羊及小鼠胎儿成纤维细胞的分离采集山羊胎儿，用含双抗的PBS溶液，青链霉素为100万单位/L，冲洗三次，置于培养皿中，去除胎儿的四肢、头部、内脏、骨骼，余下组织用含双抗的PBS冲洗数次后置于新的培养皿中，用眼科剪刀剪碎，加入上述体积2.5倍的0.25％胰酶消化，随后移至西林瓶中，并置于37℃水浴锅中消化30min，中间每隔10分钟震荡西林瓶，吸取西林瓶中上部液体，加入其体积2.5倍的含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，依次用100目、200目尼龙网筛过滤消化产物，1000rpm离心5‑10min，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整密度至1‑10×10⁶个/ml，在100mm细胞培养皿中加入细胞悬液，然后放入37℃、5％CO₂浓度培养箱中培养，待原代细胞生长至90‑100％的汇合度时，用0.25％胰酶消化传代，弃去原先培养基，用PBS溶液清洗3遍，添加1.5mL 0.25％胰酶消化细胞，然后用含10％FBS的高糖DMEM培养基终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后1000rpm离心6‑8min，收集沉淀物，含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整好细胞密度，放入37℃、5％CO₂浓度培养箱中培养，小鼠胎儿成纤维细胞的分离方法同上；五、饲养层细胞的制备取出分离冻存的GEF细胞和MEF细胞，快速解冻并用含10％FBS的高糖DMEM培养，待细胞汇合度达90％时，用含10ug/mL丝裂霉素C的高糖DMEM培养液处理2.5‑3.0h，随后用0.25％的胰酶消化细胞，以血球计数板计数，将5×10⁴mL^‑1MEF细胞和5×10⁴mL^‑1GEF细胞混合均匀并接种于0.1％明胶包被的12孔板中，用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养细胞，并在接种前2‑3h更换为设计的山羊iPS细胞培养液；六、细胞培养液的配制向500mL KnockoutDMEM培养基中加入100mL血清替代物、0.293g L‑谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、1uLβ‑巯基乙醇、5mg bFGF、5×10⁵U LIF，使培养液的最终组分及浓度为：KnockoutDMEM、20％血清替代物、1mmol/L L‑谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/L β‑巯基乙醇、10ng/mL bFGF、1000U/mL LIF；七、mRNA的转染在24孔板中，利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，按照脂质体2000：mRNA＝1：1(1uL与1uG)的比例转染接种密度为70％左右的GEF细胞，并记录此时GEF细胞的总数，间隔24h连续转染5次后，GEF细胞经0.25％胰酶消化后传至预先准备好饲养层的孔板中，用细胞培养液培养，隔天换液，直至出现山羊iPS细胞；八、诱导效率的计算将诱导获得的山羊iPS细胞用AKP染色试剂盒染色，记录AKP阳性克隆个数，利用以下公式计算诱导效率：诱导效率(％)＝AKP阳性克隆数(个)/转染前GEF细胞总数(个)；九、山羊iPS细胞的形态特征识别在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落；十、iPS细胞的挑取与传代待培养皿或培养瓶中的细胞汇合度达80％‑90％时，用胰酶消化，按照1：3‑5的比例传代，传代的细胞要接种到铺有新饲养层的孔板内培养，1个iPS集落的细胞团接种1个孔，间隔1d换液，并观察集落形态，分散的iPS细胞继续培养4‑6d，此时出现的iPS细胞集落记为F1，用相同的方法对其分离、传代，并接种于饲养层上，再出现的iPS细胞集落记为F2，依次类推，直至建立山羊iPS细胞系。