一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法

摘要

本发明涉及一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，所述酶联免疫检测方法包括以下步骤：①合成甲拌磷半抗原；②合成甲拌磷完全抗原，甲拌磷完全抗原包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；③制备甲拌磷多克隆抗体；④酶标抗原的制备；⑤用甲拌磷包被抗原包被酶标板；⑥相关溶液的配制；⑦检测。该甲拌磷的酶联免疫检测方法能够现场大量快速检测土壤、水、农产品等样品中残留的甲拌磷，该方法灵敏度、准确度和精密度高，该酶联免疫检测方法用包被抗原预包被酶标板，节约了甲拌磷抗体的用量，而且克服了直接包被抗体不利于试剂盒长期保存的问题。

主权项

一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述酶联免疫检测方法包括以下步骤：①合成甲拌磷半抗原，包括甲拌磷半抗原前体的合成和甲拌磷半抗原的合成；②并用步骤①中所述的甲拌磷半抗原合成甲拌磷完全抗原，所述甲拌磷完全抗原包括甲拌磷免疫抗原和甲拌磷包被抗原；所述甲拌磷免疫抗原是用N，N’‑二环己基碳二亚胺法将所述甲拌磷半抗原与牛血清白蛋白共价偶联所得，所述甲拌磷包被抗原是用N，N’‑二环己基碳二亚胺法将所述甲拌磷半抗原与鸡卵清白蛋白共价偶联所得；③制备甲拌磷多克隆抗体：a.将步骤②中所述的甲拌磷免疫抗原与弗氏佐剂充分混合，形成油包水的结构为止；b.将步骤a中形成油包水的结构后立即对免疫动物进行免疫注射，免疫注射的次数为4～7次；c.测定血清中抗甲拌磷抗体效价；d.用辛酸‑硫酸铵法进行纯化，得到对甲拌磷具有特异性反应的所述甲拌磷多克隆抗体；④酶标抗原的制备：采用混合酸酐法将羊抗兔或羊抗鼠与辣根过氧化物酶共价偶联制得所述酶标抗原；⑤用步骤②中所述的甲拌磷包被抗原包被酶标板，洗涤去除游离物并封闭，所述酶标板96孔或48孔的聚苯乙烯微孔板；所述封闭采用封闭液进行进行封闭，所述封闭液为非牛源血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液；⑥准备洗涤液、底物显色液、反应终止液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液以及封闭液；⑦在步骤⑤中所述的酶标板的微孔条中加入甲拌磷标样或待测样品和所述的甲拌磷多克隆抗体，反应60～70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行洗涤；再加入步骤③所述的酶标抗原，反应60～70分钟后，倒出微孔条中的液体，用所述洗涤液进行洗涤；加入所述的底物显色液，反应30min，再加入所述的反应终止液，测定OD值。