| 发明名称 | 实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法 | ||
| 摘要 | 本发明公开了一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，步骤包括：通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col-4拟南芥中；使用两个参考质粒连接载体；将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数。本发明的有益效果在于可以有效屏蔽T-DNA串联结构对识别转基因植物拷贝数的影响，而且定量PCR与Southern blot相比更加方便高效。 | ||
| 申请公布号 | CN104745696A | 申请公布日期 | 2015.07.01 |
| 申请号 | CN201510128008.0 | 申请日期 | 2015.03.23 |
| 申请人 | 安徽农业大学 | 发明人 | 魏书;席玉珍;刘晶晶;宋大鹏 |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;C12N15/84(2006.01)I;C12N15/65(2006.01)I;A01H5/00(2006.01)I | 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 代理机构 | 安徽汇朴律师事务所 34116 | 代理人 | 胡敏 |
| 主权项 | 一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T‑DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，步骤包括：通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col‑4拟南芥中，获得了300个独立转基因株系；使用两个参考质粒如序列表，该两个参考质粒都含有一个编码拟南芥高迁移率蛋白HMGA的内参基因，其中一个质粒是将HMGA基因与PSKI015载体上的BAR基因连接，另一个质粒是将HMGA基因与含有左边界LB和右边界RB的T‑DNA正向重复序列连接，分别形成TOPO_HMGA_BAR和TOPO_HMGA_LR两个参考质粒；将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数；计算公式：<img file="FDA0000686307690000011.GIF" wi="1580" he="392" />t代表目标T‑DNA基因，r代表HMGA基因R<sub>t</sub>的公式：R<sub>t</sub>＝(F<sub>at</sub>×F<sub>ct</sub>)/F<sub>bt</sub><sup>2</sup>F<sub>at</sub>，F<sub>ct</sub>，F<sub>bt</sub>分表代表植物目标基因的荧光强度。 | ||
| 地址 | 230036 安徽省合肥市长江西路130号 | ||