一种籼稻高效再生及遗传转化的方法

摘要

本发明公开了一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，步骤:（1）愈伤组织的诱导：以籼稻成熟胚或幼胚为外植体；（2）愈伤组织的继代增殖：挑选淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基培养；（3）愈伤组织的预培养；（4）农杆菌介导的胚性愈伤转化：将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工作菌液中，室温浸泡；（5）愈伤组织与农杆菌的共培养；（6）抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织进行筛选，长出新的抗性愈伤组织；（7）抗性愈伤组织的分化：将筛选后的抗性愈伤组织接入分化培养基；（8）再生苗的生根：获得生根转基因植株。筛选简便，效率高。提高了籼稻遗传转化的效率，对3个籼稻代表性品种进行了转化，转化率均在25%以上。

主权项

一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其步骤是:(1)愈伤组织的诱导：以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75％体积比的酒精浸泡，再用0.1％质量比的氯化汞浸泡10～12min，无菌水洗涤4～5次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在32～34℃下暗培养20～30天，诱导愈伤组织；(2)愈伤组织的继代增殖：从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基，置于32～34℃暗培养条件下，继代培养10～15天；(3)愈伤组织的预培养：将生长旺盛、颗粒直径2～3mm的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培养培养基上，32～34℃暗培养3～5天；(4)农杆菌介导的胚性愈伤转化：将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的农杆菌的悬浮培养基里，在菌液吸光度为OD600＝0.1～0.5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工作菌液中，室温浸泡10～20min；(5)愈伤组织与农杆菌的共培养：将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干30～60min，然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26℃下暗培养2～3天；(6)抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300～500mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡10～20min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26℃下暗培养10～15天；第二次筛选为32～34℃下暗培养15～20天，直到长出抗性愈伤组织；(7)抗性愈伤组织的分化：将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于32～34℃下2000Lux光照培养15～30天，再生绿苗；(8)再生苗的生根：将4cm以上的再生苗转入生根培养基，32～34℃,2000Lux光照培养15～30天，获得完整的生根转基因植株；所述的诱导培养基组分为：MS+2.5mg/L2，4‑D+800mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+2.5g/L植物凝胶、pH为5.8～6.0；所述的继代增殖培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L2，4‑D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，pH为5.8～6.0；所述的籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L2，4‑D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100～200uM的乙酰丁香酮，pH为5.6；所述的农杆菌的悬菌培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L2，4‑D，0.05～0.30mg/L KT，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100～200μM的乙酰丁香酮，pH为5.6；所述的籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L2，4‑D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100～200μM的乙酰丁香酮，pH为5.6；所述的筛选培养基的组分如下：以MS为培养基，添加2.0～3.5mg/L2，4‑D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，25～60mg/L潮霉素，300～500mg/L特美汀，pH为5.8～6.0；第一次筛选培养基的潮霉素浓度为25～40mg/L，第二次筛选培养基的潮霉素浓度为40～60mg/L；所述的分化培养基的组分如下：以MS为培养基，添加1.5～2.5mg/L BA，0.5～1.5mg/LKT，0.3～0.8mg/L NAA，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，pH5.8‑6.0；所述的生根培养基的组分如下：以1/2MS为培养基，添加1.0mg/L NAA，0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖，0.2g/L活性炭，6.0g/L琼脂，pH6.0。