一种环境水体中CVA10病毒的检测方法

摘要

本发明公开了一种环境水体中CVA10病毒的检测方法。方法中以根据肠道病毒属VP1血清分型区的基因保守片段设计的针对CVA10病毒的引物和探针，制备重组质粒作为标准品，建立了半巢式RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR反应体系，对环境水体中的CVA10病毒进行检测。该方法具有良好的特异性，灵敏度和精密度高，可对环境水体中的CVA10病毒进行准确的定性和定量检测。

主权项

一种环境水体中CVA10病毒的检测方法，其特征在于，方法按下述步骤进行：步骤一，样品处理：(1)病毒浓缩：首先在4℃条件下于V mL的待检测水样中加入质量百分比为8％的聚乙二醇和质量百分比为2.3％的氯化钠并混匀，接着在4℃条件下对待检测水样进行离心处理，之后弃上清液，用1mL超纯水重悬沉淀得到病毒浓缩液，其中50≤V≤250；(2)RNA提取：使用RNA提取试剂盒从病毒浓缩液中提取RNA；(3)逆转录：将5μL的RNA、2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的5×gDNA Eraser Buffer和2μL的RNase FreedH₂O在42℃条件下反应得到反应液，将该反应液与4μL的5×Buffer、1μL的RT Enzyme Mix、1μL的RT Primer Mix和4μL的RNase Free dH₂O混合进行反应：先在37℃条件下反应15min；接着在85℃条件下反应5s，得到cDNA；步骤二，定性检测(1)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Ex Taq、400 nM的上游引物CVA10‑F1、400 nM的下游引物CVA10‑R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；PCR反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次：每次循环的反应条件依次为：95℃，30s、56℃，30s、72℃，60s；③在72℃延伸5min，得到反应产物为PCR产物一；其中：上游引物CVA10‑F1的核苷酸序列为：5’‑GTCAAGCTCACTGAYCCTCC‑3’；下游引物CVA10‑R的核苷酸序列为：5’‑TGAGATCTRATTGGTCTCGG‑3’；(2)将2.5μL的10×Ex Taq Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Ex Taq、400nM的上游引物CVA10‑F2、400nM的下游引物CVA10‑R和0.2μL PCR产物一混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在梯度PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中PCR反应条件为：①95℃预变性5min；②扩增循环35次，每次循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s；③在72℃延伸5min，得到扩增产物为PCR产物二；其中：上游引物CVA10‑F2的核苷酸序列为：5’‑GATGGGCACTTTTGCAGTG‑3’(3)将所得的PCR产物二用含体积浓度为2％的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，之后切割目的条带并纯化回收，得到胶纯化回收产物；(4)采用双脱氧终止法对胶纯化回收产物进行核苷酸序列的测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA10病毒基因相似度大于70％时，则待检测水样中存在CVA10，依次进行后续步骤三和步骤四；否则，待检测水样中不存在CVA10；步骤三，标准品制备：(1)第一轮PCR扩增：以步骤一获得的cDNA为模板，利用上游引物CVA10‑F1和下游引物CVA10‑R为引物进行PCR扩增，得到第一轮扩增后的PCR产物；(2)第二轮PCR扩增：以第一轮扩增后的PCR产物为模板，利用上游引物CVA10‑F2和下游引物CVA10‑R为引物进行PCR扩增，得到第二轮扩增后的PCR产物；(3)将所得的第二轮扩增后的PCR产物用含体积浓度为2％的Gel Red核酸染料的琼脂糖凝胶跑电泳，在凝胶成像仪下拍照确认目的条带，之后切割目的条带并纯化回收，得到目的片段回收产物，该目的片段回收产物的长度为mbp；(4)将目的片段回收产物与pMD19‑T载体连接转化至大肠杆菌DH5α中，采用蓝白斑筛选法筛选出转化进插入目的片段的载体的菌落，将阳性菌在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃条件下培养12～16小时得到菌液；接着用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，其中LB液体培养基中卡那霉素的质量浓度为50μg/mL；(5)采用双脱氧终止法对得到的质粒的核苷酸序列进行测定，将所测得的核苷酸序列在NCBI基因库经BLAST比对，当所测得的核酸序列与CVA10病毒基因相似度大于等于90％时，提取的质粒为标准品，当所测得的核酸序列与CVA10病毒基因相似度小于90％时，重复步骤(4)和步骤(5)，直至提取的质粒为标准品；(6)采用微量紫外分光光度计法检测标准品的OD₂₆₀值；(7)利用式1计算标准品浓度C copies/μL：$C=\frac{n\times 50\times {10}^{-9}}{(2962+m)\times 2\times 330}\times 6.02\times {10}^{23}$   式1式1中：2962为pMD19‑T载体的长度，bp；1 OD₂₆₀＝50μg/mL的双链DNA；330为1碱基的分子量，g/mol；6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，NA；步骤四，定量检测(1)将步骤三得到的标准品稀释至c×10^‑4copies/μL、c×10^‑5copies/μL、c×10^‑6copies/μL、c×10^‑7copies/μL、c×10^‑8copies/μL、c×10^‑9copies/μL和c×10^‑10copies/μL七个浓度梯度；利用实时荧光定量PCR分别检测各浓度梯度样品的Ct值和初始模版量：x copies，接着利用测得的多组Ct‑x进行线性回归分析，得到标准曲线方程：Ct＝alogx+b   式2式2中：a和b为标准曲线方程的系数；(2)采用实时荧光定量PCR检测步骤一所获得的cDNA的Ct值：Ct₀：具体过程如下：将12.5μL的2×SYBR Mix、400nM的上游引物CVA10‑F2、400nM的下游引物CVA10‑R和2μL步骤一所获得的cDNA混合，接着用无菌超纯水补足至25μL，在实时定量PCR仪上进行扩增，同时以无菌超纯水作为阴性对照；其中的PCR反应条件为：①95℃预变性1min；②扩增循环40次，每次循环的反应条件依次为：95℃，30s、58℃，30s、72℃，60s、80.5℃，15s；其中80.5℃为读板温度；③从65℃以0.5℃/s的速率升温至95℃，在此期间每上升0.5℃读板一次，进行熔解曲线测定；(3)将Ct₀代入式2计算待检测水样中CVA10病毒的初始模板量x₀；待检测水样中CVA10病毒的含量C₁copies/mL为：$C_1=\frac{x_0(20/2)(60/5)(1000/140)}{V}$   式3。