多阶段核酸扩增

摘要

本发明公开了用于核酸扩增的改进方法，所述核酸扩增包括多重扩增，其中所述扩增是在两种或更多种不同的阶段中进行的。所述第一阶段扩增反应优选地缺乏指数级扩增所需的一种或多种组分。随后在扩增的第二、第三或进一步阶段(一个或多个)中提供所述缺乏组分，从而导致快速的指数级扩增反应。所述多阶段方案得到在低分析物浓度下更快速和更灵敏的检测，以及较低的可变性。还公开了用于进行所述受权利要求书保护的方法的组合物。

主权项

一种定量样品中的靶核酸序列的方法，包括以下步骤：(a)在允许第一扩增寡核苷酸杂交至所述靶核酸序列的第一部分的条件下，使所述样品与特异于所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸接触，从而产生包含所述第一扩增寡核苷酸和所述靶核酸序列的预扩增杂交体；(b)通过靶捕获到固体载体上，然后洗涤以移除任何未在步骤(a)中杂交至所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸来分离所述预扩增杂交体；(c)在支持在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分的线性扩增但是不支持其指数级扩增的条件下，在第一阶段扩增反应混合物中，在第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增所述在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分，从而获得包含第一扩增产物的反应混合物，其中，所述第一阶段扩增反应混合物包含第二扩增寡核苷酸，所述第二扩增寡核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸的延伸产物的一部分互补，以及其中，所述第一扩增产物不是用于在所述第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应期间进行核酸合成的模板；(d)将包含所述第一扩增产物的所述反应混合物与参与所述第一扩增产物的指数级扩增但是在包含所述第一扩增产物的所述反应混合物中缺乏的至少一种组分合并，以产生第二阶段扩增反应混合物，其中所述第二阶段扩增反应混合物另外包含序列特异性杂交探针；(e)在第二阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中在所述第二阶段扩增反应混合物中进行所述第一扩增产物的指数级扩增，从而合成第二扩增产物；(f)用所述序列特异性杂交探针以固定的时间间隔检测所述第二阶段扩增反应混合物中所述第二扩增产物的合成；以及(g)使用从步骤(f)获得的结果来定量所述样品中的所述靶核酸序列。