一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要利用粘红酵母rDNA为同源整合的靶序列，将酿酒酵母的强启动子基因PGK1和卷毛枝霉的苹果酸酶基因ME构建成表达载体引入粘红酵母，使ME基因在粘红酵母体内获得高效表达，转化株脂质含量较野生菌株提高2.5倍。本发明在了解微生物油脂合成代谢的基础上，通过导入脂质合成代谢的关键酶基因和强启动子，将为调控脂质代谢，提高油脂产量。该基因工程菌株可应用于微生物油脂的生产和功能性油脂相关产品的开发，如药品，保健品等。

主权项

一种粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法，其特征在于：利用保藏编号为CCTCC NO:M2012203粘红酵母rDNA为同源整合的靶序列，将酿酒酵母的包含强启动子的PGK1基因和卷枝毛霉的苹果酸酶基因ME构建成表达载体引入粘红酵母，使ME基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：A、目的基因的获取：（1）采用珠磨与酚氯仿结合法提取粘红酵母的总基因组DNA；将提取的总DNA纯化后点样于1%琼脂糖凝胶电泳验证，此基因组模板分装后于‑20℃保存，并用于后序的PCR反应；根据粘红酵母基因组中rDNA的保守序列设计了两对引物扩增26SrDNA D1/D2片段和5.8SrDNA‑ITS片段；（2）以卷枝毛霉基因组为模板，根据Genbank数据库中苹果酸酶同源保守的氨基酸序列设计简并引物，引物设计如下：Fr1 5'‑AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG‑3'Rr1 5'‑CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC‑3'PCR扩增得到大小为2.1kb的ME基因片段，通过A‑T克隆插入pMD‑T质粒载体，获得pMD‑ME，转入E.coli DH5α，筛选阳性转化子，经XhoI和NotI消化转入pPICZ‑E，构建pPICZ‑ME载体；（3）强启动子PGK1的获取及载体的构建提取酿酒酵母YS58基因组DNA，根据PGK1基因保守序列设计引物扩增启动子PGK1基因，引物设计如下：Fr2：5'‑ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC‑3'EcoRIRr2：5'‑TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG‑3'BamHI将PCR扩增的PGKI 基因纯化后直接与pMD18‑T载体连接，连接产物经乙醇沉淀纯化后电转化感受态细胞DH5a，经验证结果为阳性的克隆再抽提质粒进行酶切验证；B、同源重组表达载体pPICZ‑rD‑ME的构建将ME基因酶切连接到质粒pPICZ‑rD上，构建多顺反子并与抗性基因Zeocin共用一个PGK1启动子和CYC1终止子；构建的同源重组载体pPICZ‑rD‑ME转化粘红酵母菌，能整合到染色体上，便可同时表达ME基因和抗性基因。